内蒙古地区辣椒种质资源抗病性鉴定与评价

于海龙 靳 远 周黛媛 张正海 曹亚从 吴华茂 冯锡刚 张宝玺 王秀芝 崔聪聪* 王立浩*

（1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，蔬菜生物育种全国重点实验室，北京 100081；2 赤峰市农牧科学研究所，内蒙古赤峰 024031）

中国是世界上辣椒栽培面积最大和产量最高的国家，辣椒已成为中国最大的蔬菜产业（王立浩 等，2019；邹学校 等，2022；邹学校和朱凡，2022）。随着辣椒种植规模的逐步扩大，种植区域逐年固定化，辣椒病害已成为制约辣椒产业持续发展的首要因素，给农民造成了巨大的经济损失，特别是辣椒病毒病、辣椒细菌性疮痂病、辣椒炭疽病、辣椒疫病等（王立浩 等，2016）。

病毒病是辣椒生产中发生最为普遍、种类最为繁多的病害，我国报道的辣椒病毒种类达30 种以上（刘勇 等，2019）。其中以辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus，PMMoV）和番茄斑点萎蔫病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV）为代表的新型病毒病近年来在中国多地均有发现，检出比例不断增高，危害日趋严重（高苇 等，2016；Li et al.，2016；李廷芳 等，2017；刘湘宁 等，2017；孙淼 等，2017；王少立 等，2017；汤亚飞 等，2018；严丹侃 等，2018；刘勇 等，2019；王昆 等，2019；于海龙 等，2020）。

PMMoV 属于烟草花叶病毒属（Tobamovirus），L系列等位基因是烟草花叶病毒属的主要抗性基因（Boukema，1980；Genda et al.，2007；Tomita et al.，2011），L3和L4基因是目前辣椒中已发现的2 个主要的PMMoV 抗性基因，利用AFLP、遗传连锁分析及BAC 文库测序等技术已开发出与抗病位点L3和L4连锁的各类型分子标记（Sugita et al.，2004；Kim et al.，2008；Tomita et al.，2008；Yang et al.，2009），并应用于抗病材料筛选和转育（Yang et al.，2012；李宁 等，2020；张宝玺 等，2020）。

TSWV 是布尼亚病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒属（Tospovirus）典型成员（http：//www.ictv.global/），目前报道的辣椒TSWV 抗病材料都来自中国辣椒种（Capsicumchinense），如PI152225、PI159234 和PI159236 等（Black et al.，1991；Boiteux，1995）。研究表明TSWV 抗性位点Tsw已成功克隆，该基因为显性单基因，编码CC-NB-LRR 蛋白，被TSWV 的Nss RNA 沉默抑制子诱导，出现过敏性反应，导致植物抗性（Kim et al.，2017），其连锁CAPS 标记SCAC568也被开发并得到广泛应用（Moury et al.，2000；Hoang et al.，2013；李宁 等，2020）。

辣椒炭疽病是由半知菌亚门炭疽菌属（Colletotrichum）的几个种引起的全球范围内的真菌类病害（Than et al.，2008），主要危害辣椒果实，出现凹状坏死病斑。在中国，辣椒炭疽病在多省发生且危害严重，特别在高湿地区，发病较重的地块甚至会造成绝收（王莹莹 等，2014；周黛媛 等，2022）。针对炭疽菌不同致病菌株，国内外学者在辣椒不同连锁群或染色体上都鉴定到多个QTL 位点（Mahasuk et al.，2009；Lee et al.，2010；Sun et al.，2015），但迄今为止尚未克隆到目标基因。

辣椒细菌性疮痂病（bacterial spot disease）由黄单胞杆菌属细菌（Xanthomonascampestrispv.vesicatori，Xcv）引起，是辣椒生产中常见的病害之一。我国20 世纪80 年代开始发现，孙福在等（1999）报道了该病在东北三省、内蒙古、山西和北京等地区不断发生和蔓延，造成了很大的损失。辣椒细菌性疮痂病发生在幼苗、叶片、叶柄、茎、果实和果柄等部位，尤其在叶片上发生普遍（姚明华 等，2013）。目前已报道的辣椒疮痂病抗性位点主要有6 个，即Bs1～Bs6，分别对疮痂病原菌P0～P10 生理小种具有不同抗性（Sahin & Miller，1998；Jones et al.，2002），其中Bs2位点研究较为深入，应用最为广泛。Tai 等（1999a）利用遗传连锁分析将Bs2位点定位在标记S45 和S2 之间，其中S45 与Bs2位点紧密连锁，遗传距离为0.6 cM，在此基础上Tai 等（1999b）利用酵母文库和图位克隆法将Bs2基因克隆，并在番茄上进行了异源转基因验证。基于抗感材料Bs2基因3’-UTR 端差异，Truong 等（2011）开发了Bs2位点连锁标记14F/14R，并利用该标记在80 份不同背景的辣椒种质中进行验证，发现与疮痂病抗性表现完全吻合。

近年来，内蒙古自治区由于其得天独厚的气候环境，设施蔬菜产业发展迅猛。随着辣椒产业在内蒙古地区的不断发展，辣椒病害发生呈逐年上升趋势（席先梅 等，2012；张晓梅 等，2019），选育和利用抗病品种是防治病害最经济有效的措施。因此，开展辣椒抗病种质鉴定，培育抗病品种是当前辣椒育种面临的紧迫任务。本试验利用分子标记结合人工接种鉴定对内蒙古地区98 份辣椒种质资源进行PMMoV、TSWV、疮痂病和炭疽病鉴定，以期发掘抗性较好的优异种质资源，为今后抗病新品种选育和辣椒多抗聚合育种奠定材料基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试辣椒材料共98 份，编号CF1～CF98（表1），为赤峰市农牧科学研究所辣椒课题组提供的高代自交系材料，多为前期从地方品种、国内外引进的自交系及F1品种经过多代分离、纯化获得，经田间试验鉴定，其配合力和农艺表型均较好。

表1 供试辣椒材料的编号、名称及类型

1.2 试验方法

1.2.1 抗性基因的分子标记检测 2021 年春季将辣椒播种于内蒙古赤峰市农牧科学研究所农场，苗期取幼嫩叶片，采用改良CTAB 方法提取DNA，利用1%琼脂糖凝胶检测DNA 的质量，Nanodrop ND-100 分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Wilmington，DE，USA） 统一调整DNA 浓度为50～100 ng · μL-1，保存于-20 ℃备用。利用PMMoV 抗病基因L3位点连锁SCAR 标记IH1-04（Tomita et al.，2008）、CAPS 标记087H3T7（Yang et al.，2009）、TSWV 抗病基因Tsw连锁CAPS 标记SCAC568（Moury et al.，2000）、疮痂病抗病基因Bs2位点连锁SCAR 标记Bs2-L1/R1（Tai et al.，1999a）、Bs2-S45（Tai et al.，1999b）和Bs2-14F/R（Truong et al.，2011）对98 份辣椒资源进行检测。引物序列见表2。PCR 反应体系总体积为20 μL：2 ×TaqMaster Mix 10 μL（P111-01），购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司，上下游引物（10 μmol ·L-1）各1 μL，模板DNA 2 μL，其余用ddH2O 补齐，扩增程序参考PCR Mix 说明书，退火温度和延伸时间根据引物及片段大小略有调整。PCR 产物利用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，恒压180 V、30 min。其中标记087H3T7 和SCAC568 均为CAPS 类型标记，扩增后PCR 产物分别利用SspⅠ和XbaⅠ内切酶进行酶切，酶切体系和时间参考所购内切酶说明书。PCR 产物酶切后利用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，恒压160 V，50 min。依据PCR 产物片段有无和大小来鉴定植株是否含抗病基因。PI152225 为L3和Tsw位点阳性对照，ECW20R 为Bs2位点阳性对照，茄门为阴性对照。

表2 用于抗病基因检测的引物信息

1.2.2 PMMoV 苗期人工接种鉴定 根据分子鉴定结果，将鉴定含有L3位点阳性材料、4 份不含有L3位点的材料、抗病对照材料PI152225（CK 抗）、感病对照材料茄门（CK 感）进行播种，用于苗期人工接种鉴定，每个处理接种8 株，3 次重复。

PMMoV 苗期人工接种参考Çağlar 等（2013）的方法。接种前将自主分离的PMMoV 毒原PMMoV-caas（P1，2）在本氏烟上进行繁殖，取1 g 新鲜病叶加10 mL 的0.01 mol · L-1磷酸缓冲液（pH7.0），在冰浴条件下充分研磨，其匀浆作为接种液。辣椒幼苗3～4 片真叶时采用人工摩擦的方法对第1～2 片真叶进行接种。接种前在叶面上喷洒400 目金刚砂，接种后15～30 min 用自来水冲净叶面多余接种液。以磷酸缓冲液磨擦接种健康辣椒幼苗为无病对照。5～7 d后在第3～4片真叶处复接。

接种完成后将辣椒幼苗放置于人工气候室，温度控制在25～30 ℃，2 d 后观察有无过敏反应出现，14、21 d 后调查整体植株发病情况。结合有无过敏反应及植株整体发病情况确定材料抗感表型，具体标准为：若该材料超过80%的植株接种后出现过敏反应，且接种14 d 后植株整体健康，无花叶、黄化、畸形等PMMoV 典型发病症状，则该材料表型为抗病；若该材料超过80%的植株接种后无过敏反应出现，且接种14 d 后植株整体出现PMMoV典型发病症状，则该材料表型为感病；若该材料出现PMMoV 典型发病症状的植株比例低于80%，则认为该材料表型为抗感分离。

1.2.3 TSWV 苗期人工接种鉴定 根据前期分子鉴定结果，将含有Tsw位点阳性材料、2 份不含有Tsw位点材料及抗病对照材料PI152225（CK 抗）、感病对照材料茄门（CK 感）进行播种，用于苗期人工接种鉴定，每个处理接种8 株，3 次重复。

TSWV 苗期人工接种参考Hoang 等（2013）的方法。接种前将自主分离的TSWV 毒原TSWVcaas（61）在黄花烟（Nicotianarustica）上进行繁殖，取1 g 新鲜病叶加5 mL 的0.01 mol · L-1磷酸缓冲液（pH 7.0），在冰浴条件下充分研磨，其匀浆作为接种液。辣椒子叶期采用人工摩擦的方法进行接种。接种前在叶面喷洒400 目金刚砂，接种后15～20 min 用自来水冲净叶面多余接种液。以磷酸缓冲液磨擦接种健康辣椒幼苗为无病对照，5～7 d后（辣椒幼苗两叶一心至四叶一心时）进行复接。接种完成后将辣椒幼苗放置于人工气候室，温度控制在22～26 ℃。3～5 d 后观察有无过敏反应出现，10 d 后开始统计发病情况。根据植株是否出现TSWV 发病症状来确定材料抗感表型。

1.2.4 辣椒炭疽病人工接种鉴定 在98 份辣椒材料中，根据资源类型选取45 份露地类型的辣椒资源进行炭疽病接种鉴定，接种方法为针刺法（Yoon &Park，2001）。接种菌株为Colletotrichumscovillei（编号Coll-153，序列信息已提交GeneBank，登录号为 KC936995），将前期保存的菌株在固体PDA 培养基上28 ℃避光培养7～10 d，将炭疽菌转接到液体PDA 培养基中，在28 ℃、200 r · min-1的避光摇床上振荡3～5 d，使其产生大量的孢子。然后把液体PDA 用4 层无菌纱布过滤，除去菌丝以获取孢子悬浮液，在显微镜下用血球计数板将孢子悬浮液的浓度调整为5×105个 · mL-1，用于接种鉴定。

在辣椒结果期采摘转色期果实，先用自来水冲洗以去除果实表面的灰尘等杂物，再用75%的酒精浸泡果实1 min，晾干后用微注射器在果实表面刺出一个深1 mm、直径0.4 mm 的伤口并注射1 μL的孢子悬浮液。每个材料接种8～10 个果实，每个果实根据果实的大小接种2～3 个点。

接种后，在透明的塑料整理箱底部平铺4 层充分湿润的灭菌滤纸，将接种后的果实接种点朝上置于其中，整理箱放在26 ℃的培养箱中，盖上整理箱的盖子，7 d 后调查发病情况，根据病斑直径确定抗性水平。抗性评价标准（Ro et al.，2021）：抗病（R），平均病斑直径 ≤ 2 mm；中抗（MR），2 mm ＜平均病斑直径 ≤ 4 mm；感病（S），4 mm ＜平均病斑直径 ≤ 10 mm；高感（HS），平均病斑直径 ＞ 10 mm。

2 结果与分析

2.1 抗病基因连锁分子标记检测结果

利用与PMMoV 抗病基因位点紧密连锁的SCAR 标记IH1-04 和CAPS 标记087H3T7 对98 份材料进行检测，其中标记IH1-04 为显性标记，可在含有L3位点的材料中扩增出大小约150 bp 的片段，CAPS 标记087H3T7 在含有PMMoV 抗病基因L3和L4的材料中可扩增出440 bp 的条带且无法被SspⅠ内切酶切开，不含L3和L4的材料也可扩增出440 bp 的条带，但可以被SspⅠ内切酶切为300 bp 和140 bp 两条片段。

检测结果表明：98 份材料中，标记IH1-04 检测出6 份材料，即CF26（1109-1）、CF28（11-135）、CF49（18-1607A）、CF53（25-1614A）、CF69（406C）和CF72（484-12C）可扩增出相应的目的条带（表3，图1-A）；而标记087H3T7 检测发现，除上述6份材料为阳性外，CF1（02-41）和CF48（16-50A）2 份材料也为阳性（表3，图1-B），均可扩增出440 bp 的条带且无法被SspⅠ内切酶切开，表明这8 份材料在该抗性位点上均为纯合基因型。

图1 PMMoV 抗病位点连锁标记IH1-04（A）和087H3T7（B）在部分辣椒种质中的检测结果

表3 98 份辣椒种质的分子标记鉴定结果

TSWV 抗病位点Tsw连锁标记SCAC568为酶切标记，抗感材料均可扩增出568 bp 的PCR 产物，抗病材料能被XbaⅠ内切酶酶切为494 bp 和74 bp两条片段，而感病材料不能被酶切开，检测结果表明：98 份辣椒材料中4 份材料CF6（03-152）、CF43（16029-1）、CF44（16029-2）和CF96（C1304）为阳性，且均为纯合基因型（表3、图2）。

图2 TSWV 抗病位点连锁标记SCAC568 在部分辣椒种质中的检测结果

辣椒细菌性疮痂病抗病位点Bs2连锁标记Bs2-L1/R1 和Bs2-S45 为SCAR 类型特异标记，在含有Bs2位点的抗性材料中可分别扩增出约为500 bp 和900 bp 的条带；Bs2-14F/R 为共显性标记，抗病材料可扩增出约为500 bp 的条带，感病材料可扩增出600 bp 的条带。3 对标记检测结果均表明：98 份辣椒材料中有10 份材料为阳性，分别为CF13（08-16A）、CF39（15-1604A）、CF46（16-40A）、CF59（32-1549C）、CF62（34-1547A）、CF64（34-90 黄 ）、CF70（422-6）、CF79（762-6）、CF84（9204-8）和CF95（C112），可能含有Bs2位点（表3、图3）。

图3 疮痂病抗病位点连锁标记Bs2 -L1/R1（A）、Bs2 -14F/R（B）和Bs2 -S45（C）在部分辣椒种质中的检测结果

2.2 PMMoV 人工接种鉴定结果

根据前期分子鉴定结果，对2 个标记鉴定出的8 份PMMoV 阳性材料及4 份不含抗病标记目的条带的材料CF57（306-2A）、CF64（34-90 黄）、CF97（W-01-07）和CF98（保2）接种PMMoV（P1，2）病原，以含有L3基因的抗性资源PI152225为抗病对照，茄门为感病对照。接种3～6 d 后观察发现，抗病对照PI152225 和8 份阳性材料均出现明显的过敏反应（HR），接种叶片上产生枯斑。接种21 d 后，8 份阳性材料和抗病对照植株均较健康，无发病症状（图4-A、C），4 份不含L3位点的材料和感病对照均在接种10～15 d 后开始出现系统性花叶、畸形、卷叶和黄化等PMMoV 典型症状（图4-B、D）。

图4 辣椒苗期接种PMMoV 后发病情况

2.3 TSWV 人工接种鉴定结果

根据前期分子鉴定结果，对 4 份含有Tsw基因的材料CF6（03-152）、CF43（16029-1）、CF44（16029-2）、CF96（C1304），2 份不含Tsw抗性基因的材料CF57（306-2A）和CF64（34-90 黄）及抗病对照PI152225、感病对照茄门接种TSWV病原。

接种5 d 后观察发现，Tsw分子标记检测阴性的材料和感病对照均出现TSWV 发病症状，如黄化、斑驳、畸形；对照PI152225 和4 份阳性材料均出现明显的过敏反应（HR），在接种叶上产生枯斑。接种10～15 d 后，4 份阳性材料植株生长发育均正常，接种叶上部的叶片也出现HR 反应，Tsw分子标记检测阴性的材料和感病对照植株多数出现矮化，生长发育停止，叶片出现坏死斑点（图5）。

图5 辣椒苗期接种TSWV 14 d 后发病情况

2.4 炭疽病人工接种鉴定结果

采用离体果实接种法对45 份辣椒种质资源进行抗病性鉴定，结果表明（表4），辣椒果实炭疽病病斑直径介于7.33～14.94 mm 之间，45 份材料均为感病或高感，未发现炭疽病抗病种质资源。其中感病材料12 份，占26.67%；其余表型均为高感。抗病对照PBC932 平均病斑直径为1.95 mm，CF39、CF78、CF18 和CF62 病斑直径较小，小于8 mm（图6）。

图6 不同辣椒种质接种炭疽病病原菌7 d 后果实发病情况

表4 45 份辣椒种质资源接种炭疽菌后病斑直径

3 讨论

PMMoV 最早在美国发现，我国于1994 年首次在新疆地区发现（向本春 等，1994），其传播途径多样，带毒种子、感病植株和土壤均可传播，防治极为困难。随着温室、大棚等设施在我国的普及和规模化发展，由于设施内蔬菜种类相对单一，又不易轮作，PMMoV 在我国辣椒主产区检出比例持续上升，部分地区检出率超过60%，已逐渐成为危害我国设施辣椒生产的第一大优势病毒（王少立等，2017；刘勇 等，2019；王立浩 等，2021）。

利用抗病基因培育抗病品种是防治病害最经济且有效的方法之一。目前，国外育种公司在我国推广的主栽甜、辣椒新品种基本都含有PMMoV 抗病基因，导致国外品种在我国市场中长期占有主导地位（王立浩 等，2021）。因此，亟须培育具有自主知识产权的抗PMMoV 的国产辣椒品种。

本试验利用分子标记筛选结合PMMoV 人工苗期接种鉴定，最终获得了8 份PMMoV 抗病材料。此外，还筛选出4 份抗TSWV 和10 份携带疮痂病抗病位点Bs2的辣椒种质。通过对材料来源进行追溯发现，试验所用材料多为前期育种工作中从国内各地区搜集到的地方种、农家种和商业F1品种经过自主分离纯化，或是与课题早期亲本杂交后分离纯化而筛选出的农艺性状优良、配合力高的核心自交系，部分材料则采集自农家生产田或从国内其他育种单位引进，并没有记载详细原始材料名称。

调查发现，本试验筛选出的抗病种质资源全部由商业F1品种分离纯化，或与课题早期亲本材料杂交后分离纯化获得。其中4 份TSWV 抗病资源中，CF6（03-152）和CF96（C1304）分别为采集于山东和辽宁地区的瑞克斯旺公司方灯笼甜椒品种（品种名称未记载）与课题早期亲本杂交后分离获得；CF43（16029-1）和CF44（16029-2）为先正达甜椒品种红罗丹与课题早期亲本杂交后，经过6 代自交分离，根据田间表现，筛选出的农艺性状较好的2 个自交系。这也反映出国外育种企业在辣椒抗病育种方面的相关研究开展较早，因此，国内辣椒育种科研单位和企业应加快辣椒抗病自交系的转育和相应辣椒抗病品种的培育。本试验中辣椒抗病种质的挖掘，为今后新品种的培育奠定了材料基础，有助于提高国内辣椒品种竞争力。

抗病基因连锁分子标记的开发可以加速抗病资源的鉴定过程，提高抗病基因转育的效率。前人针对辣椒PMMoV 抗病位点L3和L4开发了各类型分子标记，如RAPD 标记E18272和E18286，与L3位点遗传距离4.0 cM（Sugita et al.，2004）；SCAR 标记IH1-04 和189D23M，与L3位点遗传距离小于0.1 cM（Tomita et al.，2008）；SCAR 标记L4SC340，与L4位点遗传距离小于1.8 cM（Kim et al.，2008）；CAPS 标记087H03T7，与L4位点遗传距离1.2 cM（Yang et al.，2009）；SNP 标记L4 segF & R，与L4位点遗传距离0.3 cM（Yang et al.，2012）。Yang 等（2009）研究发现基于L4位点的连锁标记087H03T7 也与L3位点紧密连锁，可用于L3位点的辅助筛选，而基于L3位点开发的标记189D23M与L4位点也紧密连锁，遗传距离仅为0.8 cM，推测L3和L4位点可能是分别位于C.chinense和C.chacoense2 个辣椒种上同一位点的不同等位基因或是2 个紧密连锁的不同抗病位点。

前期工作中，中国农业科学院蔬菜花卉研究所辣椒育种团队对上述PMMoV 连锁分子标记的适用性在不同基因型辣椒自交系中进行了验证，发现标记IH1-04 和087H3T7 较其他标记更为准确，但标记087H3T7 无法区分L3和L4基因型，这与Yang等（2009）研究结果一致。目前，我国辣椒生产区域中PMMoV 致病型多以P1，2株系为主（张强 等，2014），L3和L4位点都对PMMoV 致病型P1，2具备抗性。本试验利用分子标记IH1-04 和087H3T7 对辣椒种质资源进行筛选，分别鉴定出6 份和8 份阳性材料，其中自交系CF1（02-41）和CF48（16-50A）仅在087H3T7 标记下检测为阳性，接种鉴定发现2份材料均为抗病表型，推测CF1（02-41）和CF48（16-50A）可能含有L4抗病位点，而标记IH1-04仅与L3位点连锁并不适用，该结果有待进一步利用P1，2，3株系通过人工接种鉴定来验证。

辣椒炭疽病在世界范围内均有发生，且危害日益严重，本试验对来自内蒙古地区的辣椒种质资源进行鉴定后并未发现抗病种质，这与前人认为一年生辣椒栽培种（C.annuum）中抗炭疽病种质资源极度匮乏的结论相一致（Yoon et al.，2004；周黛媛 等，2022）。虽然也有少数研究学者在栽培种C.annuum中鉴定发现多份抗病甚至高抗种质（马荣群 等，2008；吴庆丽和秦刚，2013；彭泽 等，2022），但由于不同研究中所使用的接种方法、炭疽菌孢子悬浮液浓度、接种后培养条件、抗病等级划分标准均不相同，因此无法相互比较。此外，本试验中用于炭疽病抗性鉴定的辣椒种质均为羊角椒或甜椒类型，而张世才等（2022）研究表明，对炭疽病抗性较好的材料多为小果类型辣椒，马荣群等（2008）研究发现抗炭疽病或耐炭疽病的辣椒种质农艺性状多数较差。本试验未筛选到抗炭疽病的种质，这一结果是否与选择的辣椒材料类型有关，仍有待进一步研究。目前普遍研究表明，辣椒抗炭疽病种质资源多存在C.baccatum和C.chinense2 个种中（Lee et al.，2010；Ro et al.，2021），如C.baccatum中的PBC81、PBC80 和C.chinense中的PBC932 对炭疽菌具有良好的抗性（Kim et al.，2007；Mahasuk et al.，2009），但它们与常见栽培种C.annuum存在一定的杂交障碍，很难直接应用。因此，迄今为止商业化抗炭疽病辣椒品种十分稀缺，亟需加大抗炭疽病辣椒种质挖掘工作，特别是一年生辣椒的抗病资源，为抗炭疽病基因克隆、实用分子标记开发和抗病品种培育奠定材料基础。