河南草莓褐色叶斑病病原菌的鉴定及防治药剂筛选

袁洪波 王卓妮 覃艮红 史冰柯 王 丽 侯 珲 巩文峰 涂洪涛*

（1 中国农业科学院郑州果树研究所，河南郑州 450009；2 西藏农牧学院，西藏林芝 860000）

草莓褐色叶斑病是一种世界性的真菌病害，在波兰、巴西、比利时、美国、伊朗和韩国等地均有报道。该病由病原菌Pilidiumconcavum或Pilidium lythri引 起（Gołębniak & Jarosz，2004；Lopes et al.，2010；Debode et al.，2011；Fernández-Ortuño et al.，2014；Karimi et al.，2016；Park et al.，2017），可以为害草莓叶片、果实等组织，造成叶片坏死和果实腐烂，严重影响草莓的产量和品质。我国于2012 年在北京地区首次发现草莓褐色叶斑病（Geng et al.，2012），近年来在贵州地区也有该病发生的报道（熊仕俊 等，2020）。2020—2021 年，笔者对河南郑州、新乡、三门峡等地区草莓病害调查发现，草莓褐色叶斑病的发病面积呈扩大趋势，给果农造成了严重的经济损失。

P.concavum的寄主范围较广，除为害草莓外，还可在牡丹（Paeoniasuffruticosa）、厚叶岩白菜（Bergeniacrassifolia）、草甸水兰（Hieracium caespitosum）、橄榄（Oleaeuropaea）、虎杖（Fallopia japonica）和欧洲李（Prunusdomestica）上寄生引起植物病害（Duan et al，2010；Bruckart et al，2013；Sayari et al，2013）。目前，已有的研究报道主要集中在病原菌形态特征、生物学特性及细胞壁降解酶等方面（段亚冰 等，2010；张桂军 等，2018），而该病原菌的室内毒力测定及对草莓褐色叶斑病的防治研究报道较少，国内尚无该病害农药登记。因此，为了防止草莓褐色叶斑病的大面积流行和暴发，亟需对河南草莓褐色叶斑病病原菌进行鉴定，并在此基础上筛选高效防治药剂用于生产实践。

笔者从河南郑州草莓产区采集到草莓褐色叶斑病样品，结合形态学和分子生物学鉴定方法，明确草莓褐色叶斑病病原菌种类，并进行了致病性测定；同时，评价了该病原菌对6 种杀菌剂的敏感性，以期为草莓褐色叶斑病的田间防治提供候选杀菌剂。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试草莓品种为香野。2021 年12 月9 日在中国农业科学院郑州果树研究所草莓实验基地采集发病植株叶片，用于病原菌的分离。

1.2 病原菌分离与纯化

利用组织分离法分离草莓叶片病原菌（王丽等，2020）。具体步骤：从叶片病健交界处切下5 mm × 5 mm 组织，于75%的乙醇中消毒1 min，再用1%次氯酸钠消毒3 min，经无菌水清洗5 次后置于含氨苄青霉素（100 mg · L-1）的PDA 培养基（马铃薯200 g · L-1，葡萄糖20 g · L-1，琼脂粉15 g · L-1）上。

待组织块周围长出菌丝，用挑针挑取菌落边缘菌丝或菌块，转移至新的培养基中进行纯化培养。产孢后进行单孢纯化得到单一菌株保存备用。

1.3 病原菌鉴定

形态特征观察：将病原菌接种于PDA 培养基上，于25 ℃黑暗培养，观察病原菌在培养基上的菌落形状、颜色等，并利用显微镜观察菌丝、孢子形态等特征，初步确定真菌种属（魏景超，1979）。

分子生物学鉴定：使用CTAB 法提取病原菌基因组DNA（Möller et al.，1992）， 利用ITS 和微管蛋白Tubulin基因通用引物分别扩增。ITS 扩 增 引 物（White et al.，1990）：ITS1（5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3＇） 和ITS4（5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇）。Tubulin扩增引物（Lousie & Donaldson，1995）：Bt2a（5＇-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3＇） 和Bt2b（5＇-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3＇）。扩增程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸45 s，30 个循环，最后72 ℃延伸5 min。PCR 扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，胶回收，送北京六合华大基因科技有限公司测序。将测序结果在NCBI 数据库中进行BLAST 比对分析，得到与其序列同源性较高的相关模式菌株的序列，采用MEGA 7 软件以邻接法构建系统发育树。

1.4 致病性离体回接鉴定

选取健康、长势一致的离体草莓叶片，经无菌水清洗干净后，用75%乙醇擦拭消毒，再用无菌水清洗，晾干。用直径为5 mm 的打孔器从生长7 d 的菌落边缘打取菌块，用无菌牙签挑取菌块，带菌丝的一面贴于叶片上，以接种空白PDA 培养基为对照。接种后，用无菌水浸泡的脱脂棉缠绕叶柄保湿，置于25 ℃光照培养箱中12 h/12 h（光照/黑暗）培养，每天观察发病情况，将发病叶片进行再次分离培养鉴定，检验是否为鉴定菌株。

1.5 室内杀菌剂抑菌效果评价

采用生长速率法（王丽 等，2020）测定6 种杀菌剂对病原菌菌丝生长的抑制作用（表1）。在预试验的基础上设置不同质量浓度，其中450 g · L-1咪鲜胺水乳剂、435 g · L-1戊唑醇灵悬浮剂、500 g ·L-1多菌灵悬浮剂、40%百菌清悬浮剂和50%啶酰菌胺水分散粒剂的有效成分终质量浓度为1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 mg · L-1，30%吡唑醚菌酯悬浮剂的有效成分终质量浓度为3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400、800 mg · L-1。用直径为5 mm 的打孔器从生长7 d 的菌落边缘打取菌块，将一块菌落接种到含不同质量浓度药剂的PDA 培养基中央，以常规PDA 培养基作为对照，于25 ℃黑暗培养10 d 后测量菌落直径。每个处理、每次接种3 个平皿，试验共2 次独立重复。菌丝生长抑制率 = 〔（对照菌落直径-处理菌落生直径）/对照菌落直径〕×100%。利用DPS 软件，以各药剂浓度对数值及对应的菌丝生长抑制率概率值作回归分析，计算各药剂的抑制中浓度EC50、相关系数r以及EC5095%置信区间。

表1 供试杀菌剂

对筛选的目标药剂进行草莓褐色叶斑病的离体叶片室内药剂筛选试验，将目标药剂均匀喷施于草莓离体叶片上，待药液自然风干后再接种病原菌，病原菌接种方法参照1.4 的回接方法，无菌水处理作为对照；接种病原菌7 d 后，采用十字交叉法测量病斑大小，调查叶片发病情况，计算其防效，试验重复3 次。

叶片发病率 = （发病点数/调查总点数）×100%

防治效果 = 〔（空白对照病斑直径-药剂处理病斑直径）/空白对照病斑直径〕× 100%

1.6 数据处理

采用Excel 2021 软件统计数据并绘制图表，运用SPSS 26 计算显著性差异，运用DPS7.05 进行EC50等计算。

2 结果与分析

2.1 草莓褐色叶斑病田间病症

在河南郑州、三门峡、新乡等草莓种植基地，草莓褐色叶斑病发生普遍。发病初期，草莓叶片出现浅褐色坏死斑（图1-A），随着病情的加重，叶片病斑变为深褐色、干枯，严重时脱落（图1-B）。

图1 草莓褐色叶斑病病症

2.2 草莓褐色叶斑病病原菌形态学特征

采用组织分离法从发病植株上共分离获得4 株真菌，编号分别为CMY2-1、CMY2-4、CMY2-5和CMY2-7，经纯化后进行后续试验。4 株真菌菌落形态相似，菌落生长缓慢，产孢少，菌丝致密、浅褐色至白色，菌落边缘整齐、呈白色，可见同心纹，无渗出液（图2-A、B、C、D）；培养基背面呈黄褐色，边缘浅黄色（图2-E、F、G、H）。菌丝无色，有隔膜（图2-I）。分生孢子无色、呈肾性（图2-J）。根据形态学初步将该病原菌鉴定为P.concavum。

图2 菌株菌落、菌丝及孢子形态特征

2.3 草莓褐色叶斑病病原菌分子鉴定

利用通用引物ITS1/ITS4 对4 个菌株的DNA进行扩增，获得ITS 片段，测序比对发现这4 个菌株的ITS 序列完全一致，利用微管蛋白基因Tubulin通用引物Bt2a/Bt2b 对病原菌进行了扩增，4 个条带在同一大小区间内（图3）。表明这4 个菌株为同一个病原菌。选取菌株CMY2-4 ITS 序列（登录号为ON965254）与NCBI 数据库中进行BLAST比对分析，结果显示菌株CMY2-4 与P.concavum（登录号为KF646103.1、JX045795.1）和P.lythri（登录号为MT555770.1）序列一致性为100%。基于ITS 序列构建的系统进化树显示，菌株CMY2-4与P.concavum、P.lythri和Discohainesiaoenotherae位于同一个分支（图4-A）。进一步利用微管蛋白基因Tubulin通用引物Bt2a/Bt2b 对菌株CMY2-4进行了扩增和测序，BLAST 比对分析结果表明，菌株CMY2-4（ON989665）与P.concavum序列相似性最高为100%（图4-B）。结合病原菌形态学特征和分子生物学鉴定，将该病原菌初步鉴定为P.concavum。

图3 4 株菌株DNA 扩增结果

图4 基于ITS 和Tubulin 序列分别构建草莓褐色叶斑病原菌菌株的系统发育树

2.4 病原菌致病性鉴定

利用离体草莓叶片接种所分离的4 株菌株，接种5 d 后，叶片接种部位出现褐色，并逐渐向外扩增。接种7 d 后，接种叶片出现明显的褐色坏死斑，而对照叶片颜色正常，无任何发病症状（图5）。对发病叶片的病原菌进行了重新分离和分子鉴定，证实了包括菌株CMY2-4 在内的4 个菌株为草莓褐色叶斑病病原菌。

图5 接种7 d 后草莓叶片发病症状

2.5 室内杀菌剂的筛选

平皿测定结果显示，6 种供试杀菌剂中450 g · L-1咪鲜胺水乳剂对病原菌的抑制效果最好，抑制率达到100.0%，EC50值为2.449 7 mg · L-1，其次是435 g · L-1戊唑醇悬浮剂，抑制率为67.8%，EC50值为9.499 7 mg · L-1。另外4 种杀菌剂对草莓褐色叶斑病原菌的抑制能力较弱，抑菌率在15.6%～47.6%，EC50值在46.963 3～743.872 2 之间（表2）。

表2 6 种杀菌剂对草莓褐色叶斑病病原菌的抑制作用

为了进一步检测药剂450 g · L-1咪鲜胺水乳剂对草莓褐色叶斑病的防治效果，用终质量浓度为0.75 g · L-1的450 g · L-1咪鲜胺水乳剂处理草莓离体叶片，再接种菌株CMY2-4。接种7 d 后调查发现（图6、表3），对照处理的叶片均表现出褐色病斑，发病率为100.0%；而450 g · L-1咪鲜胺水乳剂处理后的叶片无发病症状或有轻微发病症状，发病率为33.3%，平均病斑直径仅为0.96 mm，显著低于对照处理；450 g · L-1咪鲜胺水乳剂对草莓褐色叶斑病的防效达到83%。表明450 g · L-1咪鲜胺水乳剂对草莓褐色叶斑病具有较好的防治效果。

图6 450 g · L-1 咪鲜胺水乳剂对草莓褐色叶斑病病原菌的防治效果

表3 450 g · L-1 咪鲜胺水乳剂对草莓褐色叶斑病的防治效果

3 结论与讨论

草莓褐色叶斑病是一种重要的真菌病害，在世界范围内流行。目前，草莓褐色叶斑病只在我国北京和贵州地区报道过，其中北京分离的菌株鉴定为P.concavum，而贵州分离的病原菌鉴定为P.lythri（熊仕俊 等，2020；Geng et al.，2012）。P.concavum和Hainesialythri是草莓褐色叶斑病病原菌的共无性型，其有性型为D.oenotherae（Palm，et al.，1991；赵新兰 等，2010；Rossman et al.，2014）。2014 年，Johnston 等（2014）建议用名称P.lythri替代P.concavum，但部分学者仍沿用了名称P.concavum（Karimi et al.，2016；Park et al.，2017）。本试验中，结合形态学观察以及ITS 序列和微管蛋白基因Tubulin比对结果，初步将河南草莓褐色叶斑病病原菌鉴定为P.concavum。致病性回接鉴定结果显示，草莓叶片接种病原菌5 d 出现褐色病斑，与田间发病表型类似。

草莓褐色叶斑病主要危害草莓叶片，在叶片上形成褐色圆形轮纹，发病严重时可侵染果实，导致草莓产量和品质严重降低（熊仕俊 等，2020）。因此，筛选高效的防治药剂对于防治该病害的发生尤为重要（王卓妮 等，2023）。然而关于该病害的研究主要集中在病原菌的分离、鉴定、形态特征观察等方面（段亚冰 等，2010；张桂军等，2018），而病害防治相关的研究较少，缺少有效的防治药剂。耿文龙等（2021）分析了5 种杀菌剂对P.concavum菌株CMYK-1 菌落生长的抑制效果，发现百菌清和农抗120 的抑制效果最好，但并未进一步分析这2 种杀菌剂对草莓褐色叶斑病的防治效果。本试验分析了6 种杀菌剂对P.concavum菌株CMY2-4 菌落生长抑制效果。结果显示，450 g · L-1咪鲜胺水乳剂对菌株CMY2-4的抑制效果最强。进一步防效试验结果显示，450 g · L-1咪鲜胺水乳剂能有效防治由P.concavum菌株CMY2-4 引起的草莓褐色叶斑病，该结果将为草莓褐色叶斑病田间防治提供一定的科学依据。