猪PFN1基因在骨骼肌组织中的表达模式及多态性研究

李新荻,王 宇,卢 鸿,罗布白珍,何辰庆,段梦琪,叶幼荣,张 健,商 鹏*

(1. 西藏农牧学院动物科学学院,西藏 林芝 860000;2. 西藏特色农牧资源研发省部共建协同创新中心,西藏 林芝 860000;3. 林芝市巴宜区畜牧兽医总站,西藏 林芝 860000)

前纤维蛋白1(Profilin-1,PFN1)是一种在组织中广泛表达的基因,几乎与所有细胞功能相关联,是进化过程中高度保守的肌动蛋白单体结合蛋白(G-actin),分子量为12～15 kDa[1]。骨骼肌由肌纤维组成,肌原纤维是骨骼肌收缩的物质基础;肌原纤维由粗、细肌丝构成,肌动蛋白为细肌丝的重要组分之一[2]。PFN1作为Profilin家族的首要成员,通过介导G-actin聚合影响细胞骨架的动态重组以响应胞内外信号,来调控许多重要的细胞活动过程[3]例如,细胞分裂和分化、细胞形态建成和保持等[4]。目前,对于PFN1基因的研究主要集中在因其缺失引起的细胞功能障碍和突变导致的癌症引发机制上[1],关于PFN1基因在骨骼肌中的功能探索尚处于空白,在猪上的相关研究亦未见报道。

藏猪是我国唯一的高原、高寒放牧型猪种[5],多采用放牧为主、舍饲为辅的传统养殖方式,其育肥猪增重缓慢、育肥期甚长[6]。藏猪以其胴体肉质细嫩、多汁、色鲜、味美与独有的地域特色风味[7],成为消费者的馈赠佳品与餐桌佳肴。藏猪为小型猪种,发育期长、生长缓慢[6],难以满足藏猪肉市场消费的涨幅,如何在保证肉质的前提下提高藏猪肉产量成为当下亟待解决的问题。本研究选用了30、90、180日龄三个不同生长阶段的西藏本土小型猪—藏猪,快速生长型猪—大约克猪为研究对象;通过对PFN1基因多态性与mRNA表达规律分析,初步探索PFN1基因在藏猪与大约克猪骨骼肌中的作用,为后续改良藏猪肉品质同时提高藏猪肉产量的研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

采集藏猪(n=40,饲养于西藏某藏猪开发有限公司)、大约克猪(n=40,饲养于林芝市某生态农业开发有限公司)耳组织样品,置于75%酒精中,-20 ℃保存,用于后续DNA提取。分别在30日龄(哺乳期结束)、90日龄(保育期结束)、180日龄(快速生长期)各随头机挑选8头藏猪、7头大约克猪屠宰,采集腿肌、背最长肌组织样品,迅速放入液氮,转置于-80 ℃保存,用于RNA提取。

1.2 DNA、RNA提取及cDNA制备

用苯酚-氯仿抽提法提取猪DNA,-20 ℃保存备用。用Trizol提取法进行总RNA提取;用快速反转录cDNA试剂盒(北京天根生化科技有限公司,KR180123)合成cDNA,-20 ℃保存备用。用NanoDrop 2000(Thermo公司生产)分别检测DNA、RNA的纯度和浓度;1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA、RNA的完整性。

1.3 引物设计与合成

1.3.1 基因分型引物 登录GenBank下载猪PFN1基因CDS区(登录号:NM_001244416.1)与启动子区域的DNA序列(登录号:NC_010454.4),使用Primer Premier 5.0软件及NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)网站设计基因分型引物(表1)。

表1 PFN1基因5'侧翼区、CDS区引物信息Table 1 5'-flanking region of PFN1 gene and primer information of CDS region

1.3.2 定量引物 下载GenBank中猪PFN1的mRNA序列,以GAPDH作为内参基因,利用NCBI BLAST网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)设计RT-qPCR引物(表2),用于基因的组织表达分析。以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 PFN1基因和GAPDH基因定量引物信息Table 2 Quantitative primer information of PFN1 gene and GAPDH gene

1.4 PCR扩增与测序

以藏猪和大约克猪的cDNA、DNA为模板,分别扩增PFN1基因的CDS区域、5'UTR启动子区域;PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。采用Sanger测序法对条带明亮单一,长度正确的PCR产物进行混池测序(TP、YP各10头)和个体测序(TP、YP各40头)。

1.5 基因频率、基因型频率和转录因子预测

使用ChromasPro和SnapGene软件对测序结果进行分析,统计各个突变位点的基因型频率和基因频率;用在线软件JASPAR(http://jaspar.genereg.net/)对PFN1基因的SNPs位点进行转录因子预测。

1.6 RT-qPCR

以cDNA为模板,以GAPDH作为内参基因,检测PNF1基因的mRNA相对表达量;每个样品组设置3个重复;qRT-PCR 20 μL反应体系:SYBR Green Mix(北京天根生化科技有限公司,FP171206)10 μL;上、下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL;RNase-free ddH2O 7.8 μL;cDNA模板1 μL。qRT-PCR扩增程序:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s;59 ℃退火30 s;72 ℃延伸20 s;72 ℃延伸5 min;共40个循环。mRNA的相对表达量使用2-ΔΔCt法[8]进行计算。

1.7 统计分析

利用IBM SPSS Statistics 23软件测定PFN1基因表达量的差异显著性,测定结果以P值(P-value)表示:P<0.05 时差异显著,P<0.01 时差异极显著,P>0.05 时差异不显著[9];使用Pearson's chi-squared test、Fisher Exact test对PFN1基因的基因型频率和基因频率进行卡方检验(χ2- test):χ2越大,样本的实际观测值与理论推断值之间的偏离程度越大;χ2越小,二者偏差越小;表明理论值与观测值越相符。

2 结果与分析

2.1 SNPs位点

Sanger测序结果发现,在PFN1基因5'UTR起始密码子上游2 500 bp启动子区域共发现3个SNPs位点(图1):-31 bp处发现T/C突变,记为T-31C;-1401 bp处发现A/G突变,记为A-1401G;-1542 bp处发现C/T突变,记为C-1542T。PFN1基因CDS区无突变。

图1 PFN1 基因突变位点测序峰图a. T-31C位点;b. A-1401G;c. C-1542TFig.1 Sequencing peak of PFN1 mutation sitesa. The T-31C site; b. The A-1401G site; c. The C-1542T site

2.2 基因频率和基因型频率

由表3可知,在PFN1基因5'UTR启动子区域发现3个SNPs位点,其中A-1401G、C-1542T为连锁突变位点(即A-1401G位点出现A到G碱基的突变,同时存在C-1542T位点C到T碱基的突变)。在T-31C位点存在TT、TC、CC三种基因型,藏猪优势等位基因型为CC型;在A-1401G位点存在AA、AG、GG三种基因型,藏猪优势等位基因型为GG型;在C-1542T位点存在CC、CT、TT三种基因型,藏猪优势等位基因型为TT型。于藏猪与大约克猪中的等位基因频率和基因型频率均存在极显著差异(P<0.01);两个猪品种内均符合Hardy-Weinberg平衡[10](P>0.05)。

表3 PFN1基因多态性位点基因型频率和等位基因频率Table 3 Genotype distribution and allele frequency of PFN1 Gene polymorphic site

表4 PFN1基因SNPs位点转录因子预测结果 Table 4 Transcription factors prediction result of PFN1 gene SNPs

2.3 转录因子预测

通过在线网站对5'UTR启动子区域的3个SNPs位点进行转录因子预测发现:T-31C、A-1401G、C-1542T突变后产生ASCL1、ASCL2、MYOG、MAZ、PLAGL2、Atoh1、Hand2、SREBF1等8个新的转录因子结合位点;其中,T-31C的突变导致FERD3L结合位点消失;C-1542T的突变导致MEIS1结合位点消失。

2.4 骨骼肌发育过程中PFN1基因的差异表达

由图2可以看出,PFN1基因在藏猪与大约克猪的腿肌、背最长肌中的相对表达量差异不显著(P>0.05)。在30日龄,PFN1基因在藏猪和大约克猪腿肌与背最长肌中的mRNA表达水平均高于90日龄与180日龄同组织,且30日龄在不同品种间PFN1基因表达量无显著差异(P>0.05);90日龄时,藏猪在腿肌中PFN1基因mRNA表达量显著低于大约克猪(P<0.05),在背最长肌中mRNA表达量极显著低于大约克猪(P<0.01);180日龄时,藏猪两组织中mRNA表达量皆极显著低于大约克猪(P<0.01)。PFN1基因的表达水平随着两猪种生长日龄的增加,在骨骼肌组织中呈整体下降的趋势。

图2 藏猪与大约克猪不同发育时期PFN1基因在腿肌和背最长肌中的mRNA表达量*为差异显著(P<0.05),**为差异极显著(P<0.01)Fig. 2 mRNA expression levels of PFN1 gene in the leg muscle and longissimus dorsi muscle of Tibet pigs(TP) and Yorkshire pigs(YP) at different development stages* indicates significant difference (P<0.05), ** indicates highly significant difference (P<0.01)

3 讨 论

动物细胞中profilin具有两种不同的功能:一方面,profilin结合G-actin调节肌动蛋白动态重组来响应胞内外信号,从而调控细胞的增殖、生长、存活、迁移等活动[11];另一方面,profilin可促进ATP/ADP交换,将G-actin-ATP定位到能提高肌动蛋白装配的微丝正端,促进单体结合到微丝上使微丝组成肌原纤维[12]。据Alkam D等研究,PFN1氨基酸序列在脊椎动物和低等生物上高度保守[1]。本试验克隆了猪PFN1基因的CDS区域并同源序列做比对,发现无突变位点的存在,证实了该项观点。

RT-qPCR结果显示,PFN1基因mRNA的相对表达量在骨骼肌中30日龄最高,随日龄增加而下降。有研究表明猪肌纤维数目在妊娠期已被固定,出生后骨骼肌生长主要通过肌纤维体积的增大实现[13]。Witke等[14]发现,在小鼠中PFN1是胚胎发育的所有阶段存在普遍表达的基因,敲除PFN1基因致使小鼠胚胎细胞在两细胞阶段由于细胞分裂中的缺陷而停滞,该研究证明PFN1基因对于个体早期的细胞增殖发挥着至关重要的作用。由此推测,PFN1基因高表达于骨骼肌发育早期,调节细胞的增殖与分化;而个体出生后肌纤维数目不再改变或增加,PFN1基因对肌纤维细胞的增殖等作用开始逐渐减弱,这可能是猪PFN1基因表达水平随日龄增加而逐步下降并且在不同骨骼肌组织中其表达趋势呈基本一致的原因。本试验中T-31C、A-1401G突变位点结合的新转录因子MyoG参与驱动骨骼肌纤维的终末分化[15],Koki等[16]发现若敲除MyoG,骨骼肌成肌细胞分化为正常的肌纤维受到抑制并表现为出生后高致死率;高表达MyoG则加速成肌细胞分化成熟、肌管融合,MAZ协同促进肌细胞分化的过程[17]。关联SNPs位点转录因子预测与定量结果分析,PFN1基因在肌细胞中的作用一致且符合机体发育规律。

肌纤维是骨骼肌的基本单位,肌间脂肪含量、肌纤维直径等因素对嫩度影响显著[18]。有研究表明,随着肌纤维直径的增大,肌肉嫩度相应降低;肌纤维越细,密度越大,肌肉脂肪含量越高,肉质越细嫩[19]。说明肌纤维直径与肌内脂肪是影响肉品嫩度的重要因素。据赵韶华研究,在自发性高血压大鼠肥大心肌组织中,PFN1基因的表达上调,伴随心肌细胞肥大、胶原纤维增生和肌动蛋白细胞骨架受损,而沉默PFN1基因则有助于减轻心肌纤维化程度[20]。本试验结果显示,在腿肌与背最长肌中,90、180日龄藏猪的表达量均显著或极显著低于大约克猪。由此推测,PFN1基因调控细胞骨架稳态以保持肌纤维细胞形态;而藏猪中PFN1的低表达量抑制了肌纤维直径的增大从而保持藏猪的骨骼肌肌肉嫩度。本试验中A-1401G、C-1542T两个连锁突变位点结合的新转录因子PLAGL2通过调节小GTP酶影响细胞骨架形态[21]。SREBF1对脂肪沉积有正向调控作用,增加均可显著促进细胞中脂滴的形成[22]。提示SREBF1和PLAGL2协同作用,抑制肌纤维直径增大同时提高了肌纤维与肌束间的脂肪含量[23]。综上表明,这两个连锁突变位点可能是调控PFN1基因表达形成藏猪猪肉的嫩度、风味俱佳的关键原因之一,可作为分子标记[24]。

4 结 论

本研究发现,猪的PFN1基因3个SNPs位点的多态性与骨骼肌中mRNA的差异表达相关;推测这3个SNPs位点引起的转录因子变化可能是调控其表达的关键作用位点。因此,PFN1可作为骨骼肌早期发育和肉质性状新的候选基因,为后续阐明PFN1基因在猪生长发育中的分子作用机制与分子标记辅助育种提供新思路和理论依据。