健脾法防治运动性疲劳思路探讨及其改善线粒体功能的网络药理学机制研究

彭娟， 田佳庆， 韦华妮， 潘华山，3，4， 荆纯祥

（1.广州中医药大学体育健康学院，广东广州 510006；2.广州中医药大学第三临床医学院，广东广州 510378；3.广东食品药品职业学院，广东广州 510520；4.广东潮州卫生健康职业学院，广东潮州 521000）

运动性疲劳属于运动医学领域的一个重点研究方向。国际田径联合会将运动性疲劳定义为机体在运动后，肌肉能力暂时降低，不能维持原有的运动强度的现象[1]。当运动性疲劳未及时恢复或调整，将变成一种病理现象，对健康可造成不良影响。延缓运动性疲劳的产生以及如何加速消除运动后的疲劳，是近半个世纪以来运动医学领域的重点及热点课题[2]。本研究通过分析运动性疲劳的中西医发病机制，提出健脾防治运动性疲劳的思路，并基于网络药理学方法，以健脾代表方补中益气汤为例探讨健脾法防治运动性疲劳的可能作用机制。

1 健脾以干预运动性疲劳

1.1 脾虚为运动性疲劳的核心病机现代医学有关运动性疲劳的发病机制尚未统一，目前比较公认的是“衰竭学说”和“堵塞学说”。“衰竭学说”认为，运动性疲劳产生的主要原因是运动过程中体内三磷酸腺苷-磷酸肌酸（ATP-CP）等高能磷酸物大量消耗而得不到及时补充。线粒体作为有氧呼吸产生能量的主要场所，可为生物组织和细胞提供进行生命活动所需的能量或ATP。当骨骼肌线粒体受损时，将不能继续为肌纤维收缩提供能量。“堵塞学说”认为，运动性疲劳主要是因为某些在体内大量堆积的代谢产物不能及时被消除，影响了体内正常代谢，从而造成运动能力下降。当骨骼肌线粒体受损时，将不再进行有氧呼吸，进而转为无氧呼吸，致使大量的代谢产物如乳酸在体内堆积。上述两种运动性疲劳产生机制的假说虽从不同角度提出，但均与线粒体有关，即线粒体损伤会影响骨骼肌的代谢，诱导乳酸堆积，导致运动性疲劳。

中医认为，劳动或运动（劳力、劳役、强力举重、持重远行、疾走、涉水等）均可称之为“劳”。《素问·举痛论》曰：“劳则喘息汗出，内外皆越，故气耗也”，指出过劳易致气耗，渐则演变为气虚。《景岳全书》云：“劳倦不顾者，多成劳损”，言明疲劳易引起人体损伤。竞技运动作为一种比劳动强度更大的剧烈活动，可消耗人体大量气、血，引起人体的损伤。脾作为后天之本，气血之源，最易受损。古代文献中记载的“疾使四肢则脾伤汗泄”“行役劳倦积久败脾”等，均指出过劳易伤及脾脏。提示运动性疲劳不加以防治，将损伤人体气血、损伤脾脏，最终发展成脾虚、气虚等。《灵枢·本神》记载：“脾气虚则四肢不用，五脏不安”，指出若脾气虚，则四肢功能障碍，五脏失于调和。已有研究表明，运动性疲劳脾虚证普遍存在，而运动性疲劳脾虚各证中又以脾气虚证最为常见[3]。

综上，脾虚既是运动性疲劳的关键病机，也是导致运动性疲劳程度加重的主要因素；线粒体功能障碍在运动性疲劳的发生发展过程中发挥关键作用。

1.2 健脾法防治运动性疲劳综合以上运动性疲劳的中西医发病机制可知，运动性疲劳主要涉及中医的脾和现代医学的线粒体。已有学者探讨了中医脾与线粒体二者之间的相关性[4-5]，认为中医脾的生理功能与线粒体的功能特点存在多方面的共通之处：脾主运化的功能与线粒体氧化磷酸化产能过程相吻合；在电镜下发现骨骼肌线粒体数目众多，且多沿着肌纤维整齐排列，肌肉正是依靠这些线粒体的能量代谢功能而发生收缩，若肌肉组织中的线粒体数目过少或是形态功能发生异常，则无法产生足够的ATP（其功用类似中医的“气”）来维持肌肉的收缩需求，最终会导致四肢的无力痿废。运动过程中物质消耗的补充依赖于脾胃运化以源源不断地产生营卫之气，从而促进运动性疲劳的修复。脾胃功能正常，气血生化有源，可为预防运动性疲劳提供保障。因此，采用健脾法可防治运动性疲劳，且其健脾机制可能与改善线粒体功能有关。

2 以补中益气汤为例探讨健脾法改善线粒体功能防治运动性疲劳的网络药理学作用机制

近年来，已有学者通过实验研究发现脾虚与线粒体的结构与功能异常之间存在一定相关性。彭艳等[6-7]的研究发现，脾虚证的病理机制主要为线粒体结构与功能的改变；脾虚模型大鼠出现ATP生成障碍，说明脾虚可以导致线粒体功能下降。刘文俊等[8]的研究发现，脾虚大鼠的海马神经元出现线粒体嵴减少、空泡化的结构损伤，同时伴有ATP 含量减少。屈小虎等[9]发现，脾气虚证大鼠和脾不统血证大鼠骨骼肌线粒体能量代谢存在多方面的变化，其ATP 含量、线粒体复合物活性、柠檬酸合酶（CS）活性、线粒体DNA 拷贝数、COXⅣ蛋白及其mRNA表达量均降低，细胞色素C（Cyt-C）蛋白及其mRNA 表达量均升高。由此可见，脾虚证运动性疲劳的发生机制及其诊治的思路可能与线粒体功能密切相关。

现代中药药理学研究表明，健脾中药的有效成分可通过调控线粒体功能来改善运动性疲劳。如黄燕峰等[10]指出，黄芪多糖可提高动物运动时的耐力及肌力，且其改善线粒体功能障碍的作用是通过降低机体组织内氧化应激水平、改善骨骼肌细胞线粒体自噬、刺激线粒体起源发生和维持线粒体融合－分裂平衡来完成的。杨佳丹等[11]的研究发现，在模拟高原环境下，人参皂苷Rg3可改善疲劳相关的生化指标，提高骨骼肌线粒体对自由基的消除作用和供能效力，从而延长大鼠力竭游泳的时间。杨芳芳[12]指出，红景天苷可缓解大鼠运动性疲劳的发生，通过激活Keap1-Nrf2-ARE 通路，从而提升抗氧化系统的防御能力，强化线粒体的呼吸功能。Ya H 等[13]指出，大花红景天的抗疲劳作用可能与通过调节PINK1/Parkin信号通路抑制线粒体吞噬有关。林致辉[14]指出，小建中汤可以提高小鼠的抗疲劳能力，其机制与改善线粒体功能、保持骨骼肌细胞膜完整性、防止脂质过氧化物产生等有关。以上研究表明，中医健脾法不仅对防治运动性疲劳具有明显的疗效，且提示健脾与改善细胞线粒体结构和功能关系密切。

补中益气汤为健脾法的代表方，具有健脾益气、升阳举陷的作用。以下采用网络药理学方法，以补中益气汤为例，基于健脾、线粒体功能与运动性疲劳的相互关系探讨健脾法防治运动性疲劳的作用机制。

2.1 补中益气汤防治运动性疲劳的作用机制的网络药理学分析方法

2.1.1 补中益气汤活性成分作用靶点分析 基于中药系统药理学数据库分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP；http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php），检索补中益气汤主要组成药物（黄芪、白术、陈皮、人参、升麻、柴胡、当归）的化学成分。考虑炙甘草在此方中主要起调和诸药的作用，且炙甘草活性成分较多，为避免对补中益气汤主要成分的影响，故未对炙甘草进行检索整理。对检索得到的活性成分进行汇总、整理后，利用TCMSP 数据库获得各个药物化学成分的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和类药性指数（drug-like index，DL），选取OB ≥30%且DL ≥0.18的化学成分作为有效活性成分。筛选出活性成分较高的化合物并收集其靶蛋白。去除重复的蛋白质靶点，利用UniProt 数据库（http://www.uniprot.org/）对上述靶点进行规范和矫正，物种选择为“人类”，用靶蛋白的简写表示，并转化为相应的基因靶点名称（gene symbol），构建并完善药物活性成分靶点数据库。

2.1.2 疾病基因靶点库的建立 检索运动性疲劳的疾病靶点，以“exercise-induced fatigue”“sports fatigue”和“sport fatigue”为检索词，分别在数据库OMIM（https://www.omim.org/）、GeneCards（https://www.genecards.org/） 以 及 Drugbank （https://go.drugbank.com/）中进行检索，去除重复值后，获得运动性疲劳的疾病基因靶点。

2. 1. 3 共有靶点筛选及PPI 网络构建 为进一步探究补中益气汤活性成分的作用靶点和疾病相关靶点之间的关系，将中药活性成分靶点和疾病靶点数据库进行相互映射，并对二者的靶点进行分析，获得共同靶点交集。将得到的药物-疾病潜在作用靶点数据输入String 数据库（http://string-bd.org）中，物种选择为“homo sapiens”即“人类”，构建补中益气汤防治运动性疲劳的蛋白质互作（protein-protein interaction，PPI）网络，去除无相互作用关系的靶点，输出PPI 网络图并统计关键靶点。

2. 1. 4 京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 将交集靶点上传至Metascape（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）。限定物种为“人类”，选择“自定义分析（custom analysis）”，分别进行KEGG 通路分析。KEGG 通路分析设定，P＜0.01，以确定交集靶点富集通路，进一步去除其他疾病信号通路，筛选出关键靶点富集较多的通路作为关键通路。

2.2 补中益气汤防治运动性疲劳的作用机制的网络药理学分析结果

2.2.1 补中益气汤防治运动性疲劳的活性成分及作用靶点 基于网络药理学研究补中益气汤防治运动性疲劳的作用机制发现，槲皮素、β-谷甾醇和豆甾醇可能是补中益气汤防治运动性疲劳的主要活性成分（如图1所示）。槲皮素是常见的黄酮类物质，研究[15]表明，槲皮素具有良好的抗疲劳效果；补充槲皮素能影响机体在运动过程中体内供能物质的变化，通过减少蛋白质消耗及增加脂肪消耗来提高运动耐力。在脂肪消耗增多的情况下，槲皮素可通过提高运动训练大鼠体内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的水平来增强自由基的清除效率，从而减少因脂质过氧化所产生的内源性自由基对机体的损伤，也可对线粒体起到保护作用[16]。除此之外，槲皮素还可通过改善线粒体生成来增强运动耐力[17]。豆甾醇和β-谷甾醇均为植物甾醇类成分，目前主要用于控制血脂[18]。Bouic P J 等[19]通过研究β-谷甾醇胶囊对南非马拉松志愿者的影响，发现受试者服用β-谷甾醇后，其赛后体内的白细胞介素6（LI-6）、皮质醇的上升幅度得到控制，由此可缓解因马拉松比赛引起的局部炎症反应，降低受试者的疲劳感；研究也提示存在有通过免疫调节发挥防治运动性疲劳的可能。

图1 补中益气汤防治运动性疲劳的活性成分及作用靶点Figure 1 The active components and their acting targets of， Buzhong Yiqi Decoction for the prevention and treatment of exercise-induced fatigue

2.2.2 补中益气汤防治运动性疲劳的关键靶点的PPI 网络 大脑是疲劳感知的中枢调节器，而促炎性细胞因子是大脑感知疲劳的重要介质[20-21]。补中益气汤防治运动性疲劳的关键靶点的PPI网络如图2所示。 由图2 可知，补中益气汤防治运动性疲劳的关键靶点主要为IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素1β（IL-1β）等。而IL-6、IL-1β 以及TNF家族中的TNF-α 是最重要的促炎性细胞因子。TNF-α是运动过程中最早产生的细胞因子，可诱导多种炎症介质如IL-6、IL-1β 的产生[22]。动物实验研究[22-23]已表明，高强度训练可影响机体内TNF-α、IL-1β、IL-6 等因子的水平，而电针治疗可改善此类促炎性细胞因子对中枢神经系统中5-羟色胺和多巴胺递质系统的影响，从而消除运动性疲劳。除此之外，IL-1β 还可通过调节大脑海马神经元的功能[24]和下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴神经内分泌机制以调控运动性疲劳[25]。

图2 补中益气汤防治运动性疲劳的关键靶点的蛋白互作（PPI）网络Figure 2 The protein-protein interaction（PPI）network of the key targets of， Buzhong Yiqi Decoction for the prevention and treatment of exercise-induced fatigue

2.2.3 补中益气汤防治运动性疲劳的KEGG 信号通路 KEGG信号通路富集分析结果表明，补中益气汤防治运动性疲劳可能涉及甲状腺激素信号通路、5-羟色胺能突触信号通路、缺氧诱导因子（HIF）信号通路等多种通路，结果见图3。甲状腺激素作为氨基酸衍生物，可促进机体新陈代谢和发育，提高神经系统的兴奋性。若运动过量时，甲状腺功能发生紊乱，可影响机体正常的能量物质代谢，进而影响运动耐力[26]；同时，甲状腺激素可直接作用于心肌细胞，促进钙离子的释放，可使心脏搏动加快，心脏收缩力增强[27-28]，确保运动的正常进行。5-羟色胺作为神经递质时是一种自体活性物质，机体受到刺激时，5-羟色胺负责调节人体生理变化。研究发现，小鼠体内5-羟色胺含量的提高可刺激小鼠大脑中枢神经系统，促进大脑皮质对中枢神经系统的调节，从而减少疲劳感的产生[23]。HIF 信号通路与骨骼肌细胞的营养供给及氧代谢存在着密切的联系，HIF-1α 的表达上调可增强骨骼肌的营养供应，促进疲劳的消除[29]。

图3 补中益气汤防治运动性疲劳靶点的KEGG信号通路富集分析Figure 3 The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）signal pathway enrichment analysis of the targets of， Buzhong Yiqi Decoction for the prevention and treatment of exercise-induced fatigue

3 小结

运动性疲劳在一定程度上可影响体育运动者的竞技水平，任其发展会对人体健康造成不良影响。本文基于文献分析及网络药理学研究的方法，提出了健脾防治运动性疲劳的思路，并以补中益气汤为例探讨了健脾防治运动性疲劳的可能机制。分析结果显示，脾虚是运动性疲劳的重要病机，线粒体功能障碍在运动性疲劳的发生发展过程中发挥关键作用。中医健脾法对防治运动性疲劳具有明显优势，而调节线粒体功能可能成为中医防治运动性疲劳的疗效机制研究的切入点。今后有关运动性疲劳防治的研究，应充分发挥中医的传统优势，有机整合分子生物学，进一步深化对健脾法防治运动性疲劳潜在机制的认识，深入挖掘与调控线粒体功能有关的新的治疗靶点，为健脾法防治运动性疲劳提供依据。