清郁和降汤抑制反流性食管炎大鼠5-HT释放及TGR5/TRPA1通路蛋白表达

2023-11-28周易黄雨晴叶松

广州中医药大学学报 2023年12期

周易，黄雨晴，叶松

（1.湖北中医药大学，湖北武汉 430065；2.湖北省中医院，湖北武汉 430061）

反流性食管炎（reflux esophagitis，RE）为临床常见的消化系统疾病，其症状表现复杂，典型症状包括反复发作的烧心和反酸，其他症状还包括胸痛、腹痛、吞咽困难、咳嗽、咽喉炎等[1]，且发病率仍在不断增高[2]。本课题组前期研究已经证实，清郁和降汤治疗肝胃郁热型RE 患者，有较好的疗效及安全性[3-5]；但其具体机制尚不明确。现阶段研究表明，RE 的发病机制与抗反流防御功能的减弱、反流物对食管黏膜的攻击作用增强、胃排空延迟、内脏高敏感、遗传及精神心理因素等多种因素有关[2]，5-羟色胺（5-HT）分泌异常在RE的发病过程中扮演重要的角色。5-HT 由肠道中肠嗜铬细胞（ECs）产生，能够与肠神经系统（ENS）上的多种受体结合，是胃肠反射的关键激活剂[6-7]，还是与抑郁、焦虑等情绪密切相关的激素之一[8-10]。G 蛋白偶联胆汁酸受体（TGR5）是ECs 细胞中的受体之一，能够促使ECs 细胞释放5-HT[11]。瞬时受体电位锚蛋白1（TRPA1）和瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）作为人体细胞中介导内脏敏感性的物质，同样能够受到TGR5 的影响，进而诱导神经源性炎症，介导病理条件下的内脏感觉高敏感[12]，促进RE 的发生。因此，本研究通过构建RE大鼠病理模型，观察清郁和降汤对RE 大鼠TGR5/TRPA1 通路及血清5-HT 等的影响，进一步探讨清郁和降汤对RE 的干预机制，以期为其临床治疗RE提供参考，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物48只SPF级雄性SD大鼠，体质量180 ～200 g，购自三峡大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（鄂）2022-0012。饲养于湖北中医药大学实验动物中心SPF级实验室，实验动物使用许可证号：SYXK（鄂）2023-0067。随机分笼，自由进食饮水，12 h 光照、12 h 黑暗交替。实验动物方案已获得湖北中医药大学动物伦理委员会审批，批号：HUCMS202204018。适应性喂养7 d后开始进行造模。

1. 2 药物清郁和降汤组成：柴胡10 g、枳壳10 g、厚朴10 g、炒莱菔子15 g、陈皮10 g、砂仁6 g、黄连6 g、吴茱萸3 g、佛手10 g、香橼皮10 g、郁金10 g、延胡索10 g、川楝子10 g、赤芍10 g、白芍10 g、海螵蛸10 g。所有中药材由湖北省中医院中药房提供。应用自动煎药机进行煎煮、浓缩，4 ℃冰箱中储存。成人用量为日1剂，每日2次，每次200 mL。泮托拉唑钠肠溶片，由湖南九典制药股份有限公司生产，批准文号：H20093501，40 mg/片，成人用量每日2 次，每次1 片；枸橼酸莫沙比利片，由成都康弘药业集团股份有限公司生产，批准文号：H19990313，5 mg/片，成人用量每日3 次，每次1 片。动物灌胃剂量按成人体表面积换算。

1.3 试剂与仪器PCR产物Universal DNA 纯化回收试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]；建库试剂盒进行文库的构建：NEB Next®Ultra DNA Library Prep Kit（美国Illumina 公司）。5-HT、色氨酸羟化酶1（TPH1）、P 物质（SP）、降钙素基因相关肽（CGRP）等酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（江苏酶免实业有限公司）；TGR5 抗体、TRPV1 抗体、磷脂酶C（PLC）抗体（武汉三鹰生物科技有限公司）；TRPA1 抗体、蛋白酶激活受体2（PAR2）抗体（美国Affinity 公司）；山羊抗小鼠/兔辣根过氧化物酶（HRP）标记IgG 二抗（美国Jackson 公司）。RM2016 病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；Eclipse E100 正置光学显微镜、DS-U3 成像系统（日本尼康公司）；CR21GⅡ高速冷冻离心机（日本日立公司）；ABI 5700 荧光定量PCR 仪（美国Applied Biosystems 公司）；FlexStation 3 多功能酶标仪（美国Molecular Devices 公司）；DYCZ-24DN 垂直电泳槽、DYCZ-40 电转仪（北京六一仪器厂）；TS-1 水平摇床（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）；CPA 电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

1.4 分组、模型制备与给药将48只大鼠随机分为假手术组，模型组，中药低、中、高剂量组及西药组，每组8 只。按照参考文献方法[4]，采用前胃结扎结合外置幽门部分结扎术构建RE 大鼠模型。操作步骤：所有大鼠于术前24 h 开始禁食，自由饮水。除假手术组，其余各组大鼠麻醉满意后进行备皮，沿腹中线中段开口约2 cm，进入腹腔，寻找胃部组织并向下拉出，充分游离胃部及幽门附近组织。先以3-0 线绕过前胃并将前胃结扎，然后以3-0 线绕过幽门，把直径为0.38 mm 的玻璃棒置于幽门上，将幽门与玻璃棒一同进行结扎，再将玻璃棒抽出，最后将胃部放入原位置后关腹。假手术组大鼠以同样方式进行麻醉、开腹，将胃部组织提出暴露约5 min 后，放回原位置，关腹。造模后将所有大鼠给予常规消毒后放回动物房中，术后第1 天均禁食不禁水，术后第2 天均给予少量进食，术后第3 天恢复正常饮食。造模后2周，所有大鼠均存活。

术后第15天开始灌胃。按成人体表面积换算成动物给药剂量。中药低、中、高剂量组分别对应给予清郁和降汤7.9、15.8、31.6 g·kg-1·d-1灌胃；西药组给予泮托拉唑蒸馏水混悬液8.4 mg·kg-1·d-1、莫沙比利蒸馏水混悬液0.19 mg·kg-1·d-1灌胃，假手术组与模型组给予等体积蒸馏水灌胃。以上药物及蒸馏水均以10 mL/kg进行灌胃，每日1次，连续灌胃14 d。

1.5 取材所有大鼠连续灌胃14 d 后，禁食不禁水24 h。所有大鼠麻醉满意后，经腹主动脉采血，离心取上清置于-80 ℃冰箱待检。取贲门处及向上2 cm食管组织，将食管组织纵向分成2部分，一部分置于4%多聚甲醛溶液中进行固定和保存，用于病理切片制作，另一部分用于Western Blot 及PCR检测，置于-80 ℃冰箱待检。

1.6 观察指标与方法

1.6.1 大鼠一般状态每日观察并记录各组大鼠毛发色泽、体质量、进食量、饮水量、精神状态、活动等一般状态。

1.6.2 食管黏膜病理学观察取食管组织，制备常规病理切片，HE 染色后，显微镜下观察大鼠食管黏膜病理形态学表现。

1.6.3 ELISA法检测血清5-HT、TPH1、SP、CGRP含量将大鼠血液于4 ℃、3 000 r/min（离心半径4 cm）离心20 min，收集上清液，按照5-HT、TPH1、SP、CGRP ELISA试剂盒说明书进行检测。

1.6.4 Western Blot法检测食管组织TRG5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2 的蛋白表达取食管组织，置于冰上裂解30 min，离心，收集上清。将蛋白样品放入沸水浴10 min 进行变性，然后电泳，转膜（PVDF），封闭。加入TRG5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2 等一抗（1∶1 000 稀释）4 ℃孵育过夜，洗膜；加入HRP 标记IgG 二抗（1∶5 000 稀释），洗膜；加入增强化学反应试剂，待荧光带明显后，进行显影和定影。最后应用Image-pro Plus 软件分析胶片条带灰度，结果以目的蛋白条带灰度值与内参蛋白灰度值比值表示目的蛋白的相对表达量，内参为GAPDH。

1.6.5 实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）法检测食管组织TRG5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2的mRNA 表达取食管组织，提取总RNA 后，在42 ℃、30 min，85 ℃、5 s 的条件下，用第一链cDNA 合成试剂盒将提取的总RNA 反转成cDNA，在95 ℃预变性30 s，1 个循环，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，40个循环的条件下，对cDNA 进行PCR 扩增。引物序列：TGR5 上游5’-CCCTCATCG TCATCGCCAACC-3’，下游5’-GGAAGAAGCAG CCAGCAGGTG-3’，片段长度87 bp；TRPA1 上游5’-ATCCAAATAGACCCAGGCACG-3’，下游5’-CAAGCATGTGTCAATGTTTGGTACT-3’，片段长度227 bp；TRPV1 上游5’-GTGACGCTGATTGAA GAC-3’，下游5’-CCGATGGTGAACTTGAAC-3’，片段长度168 bp；PLC 上游5’-GCCGAGTATTGCC GATTA-3’，下游5’-ACTTCCCTCTGACTACTT-3’，片段长度235 bp；PAR2 上游5’-CAGTGGCA CCATCCAAGGAA-3’，下游5’-CAGTGGCACCAT CCAAGGAA-3’，片段长度138 bp。引物由武汉赛维尔生物科技有限公司合成。最后采用2-ΔΔCt方法计算目的基因的相对表达水平，内参为GAPDH。

1.7 统计方法采用SPSS 26.0统计学软件进行数据分析。若数据符合正态分布，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著性差异法检验；若数据为非正态分布，则采用非参数秩和检验。以，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 各组大鼠一般状态比较所有大鼠均存活。其中：假手术组大鼠毛发色泽光鲜、精神充沛、活动敏捷，食量较多；给予造模手术的大鼠出现不同程度的精神萎靡，活动减少，毛发色泽晦暗，进食饮水量减少，体质量增加不明显等表现；开始药物灌胃后，中药低、中、高剂量组及西药组大鼠的症状均出现不同程度的改善。

2.2 各组大鼠食管病理学表现比较图1 结果显示：假手术组大鼠食管黏膜中未见明显炎症反应；模型组大鼠可见食管鳞状上皮增厚及少量基底细胞增生，部分黏膜糜烂；中药低、中、高剂量组及西药组大鼠食管黏膜鳞状上皮增生及炎性细胞浸润均有所改善，未见明显糜烂或溃疡，其中，中药中剂量组对食管黏膜的恢复作用最佳，可见食管黏膜无鳞状上皮及基底细胞增生，未见糜烂和溃疡。

图1 各组大鼠食管病理学表现比较（HE染色法，×100）Figure 1 Comparison of pathological manifestations of the oesophagus among each group of rats（HE staining method，×100）

2.3 各组大鼠血清5-HT、TPH1、SP、CGRP含量比较图2结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠血清5-HT、TPH1、SP、CGRP 含量均显著增高（P＜0.01）；与模型组比较，中药低、中、高剂量组及西药组大鼠血清5-HT、TPH1、SP、CGRP 含量均显著降低（P＜0.01）；中药中剂量组大鼠血清5-HT、TPH1、SP、CGRP含量最接近假手术组。

图2 各组大鼠血清5-HT、TPH1、SP、CGRP含量比较Figure 2 Comparison of serum 5-HT，TPH1，SP and CGRP levels among each group of rats

2.4 各组大鼠食管组织中TGR5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2 的蛋白表达比较图3、表1 结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠食管组织TGR5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2 蛋白表达水平均显著增高（P＜0.01）；与模型组比较，中药低、中、高剂量组及西药组大鼠食管组织TGR5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2蛋白表达水平均降低（P＜0.05），其中，以中药中剂量组表达最低。

表1 各组大鼠食管组织TGR5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2 蛋白相对表达量比较Table 1 Comparison of relative protein expressions of TGR5，TRPA1，TRPV1，PLC and PAR2 in oesophageal tissue among each group of rats （±s）

注：①，P＜0.01，与假手术组比较；②，P＜0.05，与模型组比较

组别假手术组模型组西药组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组鼠数/只888888 TGR5 0.09±0.02 0.61±0.05①0.23±0.07②0.24±0.05②0.18±0.05②0.25±0.02②TRPA1 0.53±0.05 0.89±0.05①0.66±0.06②0.69±0.01②0.60±0.01②0.67±0.01②TRPV1 0.38±0.03 0.78±0.05①0.49±0.05②0.51±0.09②0.41±0.06②0.45±0.04②PLC 0.34±0.02 0.64±0.08①0.50±0.04②0.52±0.03②0.38±0.05②0.55±0.02②PAR2 0.64±0.05 0.96±0.06①0.80±0.05②0.81±0.07②0.69±0.07②0.78±0.02②

图3 各组大鼠食管组织中TGR5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2的Western Blot电泳条带图Figure 3 Western Blot electrophoretic strip plots of TGR5，TRPA1，TRPV1，PLC，PAR2

2. 5 各组大鼠食管组织TGR5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2的mRNA表达比较表2结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠食管组织TGR5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2 的mRNA 表达水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，中药低、中、高剂量组及西药组大鼠食管组织TGR5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2 的mRNA 表达水平降低（P＜0.05）；中药中剂量组上述各指标的蛋白表达水平最接近假手术组。

表2 各组大鼠食管组织TGR5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2 的mRNA相对表达量比较Table 2 Comparison of relative mRNA expressions of TGR5，TRPA1，TRPV1，PLC and PAR2 in oesophageal tissue among each group of rats （±s）

注：①，P＜0.01，与假手术组比较；②，P＜0.05，与模型组比较

组别假手术组模型组西药组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组PAR2 48.12±13.51 148.12±35.19①82.30±27.34②70.40±30.96②65.26±21.20②90.10±21.54②鼠数/只888888 TGR5 10.48±10.28 65.65±37.21①29.84±12.90②29.11±14.49②18.55±13.64②22.84±18.45②TRPA1 8.84±0.64 57.80±39.71①23.54±17.36②21.31±18.66②10.78±7.09②18.45±6.49②TRPV1 7.84±8.20 54.75±15.94①29.84±11.76②31.59±20.14②19.24±9.84②33.45±17.68②PLC 149.20±38.03 286.01±20.01①192.20±19.75②163.66±24.67②188.17±20.24②198.54±31.75②

3 讨论

反流性食管炎（RE）归属于中医学“吐酸”“食管瘅”等范畴，其基本病机为“胃失和降，浊气上逆”，以和胃降逆为治疗大法。RE的中医病机特点有三，“一为逆，二为热，三为郁”，均与肝密切相关[1]。肝属木，主疏泄，喜条达而恶抑郁，肝气郁滞，再乘脾土，导致肝胃、肝脾不和；气机郁滞日久，有余而化火，火邪生酸，肝胆邪热犯及脾胃，致脾气不升，胃气不降，肝不随脾升，胆不随胃降，最终出现胃气挟火热之邪而上冲；脾胃亏虚，无以运化水湿，进而导致痰浊内蕴，痰浊与郁滞的气机阻隔于胸膈，胃气不得降而终上逆，最终出现胃中内容物侵袭食管，造成黏膜损伤及反酸、烧心等症状。现代医学研究[13-14]表明，内脏高敏感是包括RE 在内的多种消化道系统疾病的主要发病原因。由内脏高敏感所形成的内脏超敏反应与情绪不佳、潜在心理异常等原因相关[15-16]，该观点与中医观点中的“肝郁”表现出的情志活动异常有异曲同工之妙。而不良情绪与心理会导致机体对生理和有害刺激的感知增强，同时也对食管造成更多的反流[16]，最终导致RE 的发生。

在本研究中，清郁和降汤以和胃降逆为主、佐以清热疏肝为治疗大法。方中以柴胡疏肝解郁，条达肝气，鼓舞脾胃清阳上行，为君药。枳壳、厚朴调中焦之气机升降，以降为主，与柴胡相伍，一升一降，加强气机之调理；黄连与吴茱萸一清一温，辛开苦降，使肝气得疏，肝火得清，胃气得降；郁金既可助柴胡疏肝解郁，条达肝气，又可活血行气止痛：故以枳壳、厚朴、黄连、吴茱萸、郁金共为臣药。莱菔子消食降气除胀，陈皮理气健脾和中，砂仁醒脾和胃，三药合用，可健运中州，恢复中焦气机升降；佛手、香橼皮同归肝经、胃经，善疏肝解郁，理气调中；川楝子疏肝气、泻肝火，延胡索行气活血止痛，两药相配，可使气行血畅，疼痛自止；白芍酸敛肝阴，养血柔肝止痛；赤芍善清肝泻火、泄血分郁热；海螵蛸制酸敛疮降逆，为治疗胃酸过多之佳品：共为佐药。如叶松教授所言：盖气行则气血痰火湿食等邪皆能消散矣[17]。本课题组前期应用清郁和降汤治疗肝胃郁热型RE 患者，获得良好的疗效[3-4]。本研究结果表明，清郁和降汤可明显改善RE大鼠食管黏膜病理损伤。

5-HT 是中枢神经系统（CNS）中的一种关键神经递质，在调节肠道动力和神经功能方面均发挥着十分重要的作用[18]。研究[19]表明，5-HT 可激活结肠中含降钙素基因相关肽（CGRP）感觉神经元上的5-羟色胺4（5-HT4）/5-HT1P 受体，启动结肠蠕动反射，同时亦可通过与5-羟色胺3（5-HT3）受体结合，引发结肠节律性推进运动的产生和传播，推动粪便颗粒由近端结肠向肛门移动。5-HT 除了能够在肠道中发挥作用之外，同样能够影响到大脑[20]。5-HT 以色氨酸（Trp）作为前体，在色氨酸羟化酶（TPH）的参与下生成；TPH 能够控制5-HT 的合成速率[21]。TPH 又包含TPH1 和TPH2 两种亚型，前者存在于ECs细胞内，后者主要在大脑中缝核中发现[22]。作为脑-肠互动中重要的神经递质之一，5-HT 的过度表达和堆积能够触发兴奋性毒性，损伤迷走神经调控功能，进而导致内脏高敏感状态[23]。TGR5 能够在ECs 细胞中激活细胞膜上的磷脂酶C（PLC），进而促进5-HT 的分泌[24]，与此同时，细胞中的蛋白酶激活受体2（PAR2）受到PLC活化的影响，激活蛋白激酶C，引起TRPV1 磷酸化，激活TRPV1，提高TRPV1 对内源性激动剂的敏感性[25]。TRPA1 也会被激活[26]。二者均是瞬时受体电位（TRP）通道家族中的成员，该家族的蛋白与疼痛相关通路表达密切相关[27]。TRPV1 磷酸化后，细胞外的钙离子内流，引发神经末梢去极化反应，释放CGRP 和SP[28]，进而导致渗出及炎症反应，反应在机体上即为疼痛和烧心等症状[29-30]。TRPV1 和TRPA1 的激活形成正向联动效应，加重炎症及疼痛[31]。目前认为，RE 与TRPV1 密切相关，其作用机制可能与内脏高敏状态有关[29]，TRPA1 是TRPV1 的受体之一，且广泛分布于胃肠道中[32]，其所介导的通路同样能够引起内脏敏感性及感觉异常的情况[33]。故推测，TGR5/TRPA1 通路异常，影响5-HT 分泌，进而导致内脏高敏感情况的出现，最终发生RE。本研究结果显示，模型组大鼠血清中5-HT、TPH1、SP、CGRP 含量显著增高，食管组织中TRG5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2 的mRNA 及蛋白表达水平显著增高，与假手术组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；中药低、中、高剂量组及西药组各指标均得到明显改善。表明清郁和降汤可有效抑制食管TGR5/TRPA1通路，减少5-HT的释放，改善食管敏感性。

综上所述，本研究成功建立了RE 大鼠模型，食管TGR5/TRPA1 信号通路关键产物如TRPA1、TRPV1、5-HT 表达均有所增高，呈内脏高敏感状态，而应用清郁和降汤可显著降低RE 大鼠血清中5-HT、TPH1、SP、CGRP 的释放，同时降低大鼠食管TGR5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2 的蛋白及mRNA 表达，进而纠正大鼠内脏高敏感，对RE起到良好的治疗作用。