靛蓝对白细胞介素4诱导的RAW264.7巨噬细胞极化的影响

张堂堂， 颜先伟， 林钰， 雷海青， 黄伟乐， 刘靖，3

（1.广州中医药大学，广东广州 510405；2.广州中医药大学岭南医学研究中心，广东广州 510405；3.广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405）

银屑病（psoriasis）是临床难治的慢性复发性、炎症性皮肤疾病，以红斑、鳞屑、瘙痒为主要表现。《诸病源候论·干病候》中称之为“干癣，但有匡郭，皮枯索痒，搔之白屑出是也”。《外科证治全书》中详细描述了银屑病的症状：“白疕，一名疕风，皮肤燥痒……十指间皮厚而莫能搔痒。”临床上银屑病的西医治疗手段较多，但疗效并不十分满意[1]。中医药因安全性高，广泛应用于银屑病的治疗中，疗效良好。

板蓝根、大青叶、青黛是治疗银屑病方剂中的常用中药，具有清热解毒、凉血消斑的功效，用于温毒发斑，均被证实能有效治疗银屑病[2-3]。靛蓝（indigo）作为上述药味的共同有效成分之一，是一种脂溶性生物碱成分。课题组前期研究发现：外用靛蓝乳液可以改善银屑病小鼠模型的表皮厚度、减轻红斑浸润及鳞屑，降低皮损中炎症因子的表达，展现出良好的治疗效果；同时在细胞水平，靛蓝还能对炎症状态下的巨噬细胞产生抗炎活性，抑制肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β、IL-6 的表达[4]。目前研究[5]表明，巨噬细胞存在于银屑病的皮损中，参与银屑病炎症状态的发生发展，抑制皮损中巨噬细胞的浸润可以减轻表皮增殖、红斑鳞屑等银屑病的病理变化及皮损表现。因此，本研究以IL-4 诱导RAW264.7 细胞，建立巨噬细胞M2 极化模型，同时用不同浓度的靛蓝进行干预，比较IL-4 诱导与靛蓝对RAW264.7 细胞极化的差异，进一步探讨靛蓝抗银屑病机制，以期为靛蓝的临床运用提供参考依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞系及培养小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系RAW264.7，购自中国源井生物公司，批号：YC-C020。以α-MEM 培养液（加入10%胎牛血清+0.1%青链霉素双抗）培养，于37 ℃、5% CO2条件下进行常规培养和传代操作。

1.2 药物、试剂与仪器靛蓝（分子式C16H10N2O2，分子量262.26），结构式见图1，纯度100%，购自中国成都瑞芬思生物科技有限公司；α-MEM 培养基、胎牛血清、青链霉素双抗、胰蛋白酶均购自美国Gibco 公司；二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma 公司；细胞计数试剂盒8（CCK-8），美国GlpBio 公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）试剂盒（上海碧云天公司）；IL-4（美国Peprotech 公司）；2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix（Servicebio 公司）；兔抗IL-10 抗体（万类生物公司）；兔抗TNF-α抗体、兔抗精氨酸酶1（Arg-1）抗体、兔抗GAPDH 抗体（美国Affinity 公司）；山羊抗兔IgG 二抗（美国Thermo Scientific 公司）；增强化学发光（ECL）显色液（美国Bio-Rad 公司）。B16UU型CO2培养箱（德国Heraues 公司）、ABI 7500 型荧光定量PCR 仪器（美国Applied Biosystems 公司）。

图1 靛蓝结构式Figure 1 Structural formula of indigo

1. 3 巨噬细胞M2 极化模型制备取处于对数生长期的RAW264.7细胞，重悬后，调整细胞密度为1 × 106个/mL，将100 μL 细胞悬液加入100 mm 培养皿中，加入5 mL培养基并加入终浓度为20 ng/mL的IL-4 刺激3 d 制备巨噬细胞M2 极化模型。检测M1 极化指标Arg-1 mRNA 表达量变化，若IL-4 干预后Arg-1表达上调，则判断为造模成功[6]。

1.4 采用CCK-8法观察不同浓度靛蓝对RAW264.7细胞活力的影响取对数生长期的RAW264.7 细胞，分别加入含终浓度为0、0.004、0.04、0.4、4、40、400 μmol·L-1靛蓝的培养基，用培养基将细胞密度调整为1×105个/mL，每孔100 μL细胞悬液接种于96孔板，在37 ℃、5%CO2条件下培养3 d。然后，加入10%的CCK-8试剂10 μL，在细胞培养箱中孵育1.5 h，应用酶标仪在波长450 nm 处测量每个孔的吸光度（OD）值。计算各组细胞存活率：细胞存活率=实验组OD 值/对照组OD 值× 100%。依据CCK-8 实验结果，选择无毒的3 个浓度（0.4、4、40 μmol·L-1）作为后续实验靛蓝的低、中、高浓度。

1.5 细胞分组与处理取生长状态良好的RAW264.7细胞，重悬后将细胞密度调整至1×106个/mL，于100 mm 培养皿中加入10 mL 培养基，每皿接种100 μL细胞悬液。分为5组：空白对照组，正常培养基培养；IL-4 诱导组，按照“1.3”项方法制备RAW264.7 巨噬细胞M2 极化模型；靛蓝0.4、4、40 μmol·L-1组，按照“1.3”项方法制备RAW264.7巨噬细胞M2 极化模型，同时对应给予含靛蓝终浓度为0.4、4、40 μmol·L-1的培养基。处理3 d。

1.6 实时荧光定量PCR 法检测细胞诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、Arg-1 的mRNA 表达按“1.5”项中方法处理干预3 d 后，收集RAW264.7 细胞。将重悬后的细胞加入离心管中，用TRIzol 法提取RNA，紫外分光光度计确定RNA 样品的浓度及纯度（需注意以下要求：OD260/OD280＜2.1，OD260/OD230＞1.5）。测定RNA 浓度后进行逆转录为cDNA，以cDNA 为模板，进行荧光定量PCR 反应。使 用2 × Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix 配制20 μL 定量PCR 反应体系。使用荧光定量PCR 仪进行扩增及定量检测，按照SYRB 说明书“Stage 1 预变性1 个循环（95 ℃、30 s），Stage 2 变性（95 ℃、15 s）、退火/延伸（60 ℃、30 s）40 个循环，Stage 3 溶解曲线”为程序对样品进行扩增。以融解曲线判断是否存在非特异扩增。引物序列见表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用2-ΔΔCt法检测目的基因相对表达量，β-actin为内参。

表1 定量PCR引物序列表Table 1 Sequence list of quantitative PCR primers

1.7 Western Blot法检测细胞Arg-1、IL-10、TNF-α的蛋白表达按“1.5”项中方法处理干预3 d 后，收集RAW264.7 细胞。使用放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液提取蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）法定量，然后用10% 十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶上样电泳。电转至0.22 μm 的PVDF 膜上。脱脂牛奶室温封闭2 h，加入Arg-1、IL-10、TNF-α、GAPDH 抗体（体积比1∶1 000 稀释）4 ℃孵育过夜，再置于山羊抗兔IgG 二抗（体积比1∶3 000 稀释）中室温孵育2 h，洗膜后加入混合好的ECL 化学发光液充分反应，用全能型凝胶成像系统（ChemiDoc MP）进行扫描拍照，根据不同发光强度调整曝光条件。使用ImageJ 确定蛋白电泳条带的灰度值。以目的蛋白条带与GAPDH 条带灰度值比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.8 统计方法采用SPSS 26.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，符合正态分布的多组数据间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），符合正态分布与方差齐性的两组独立计量资料采用两独立样本，t检验，不符合正态分布，方差不齐则采用秩和检验，以，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-4诱导RAW264.7细胞形态学的变化图2结果显示：未经IL-4 诱导的空白对照组，细胞形态大多数为圆形、椭圆形，部分呈不规则型；RAW264.7 细 胞 经20 ng/mL 的IL-4 诱 导3 d 后，部分细胞形态呈规则圆形，部分呈梭形。表明IL-4诱导AW264.7 细胞形态学变化符合巨噬细胞M2极化表现。

图2 IL-4诱导RAW264.7 细胞形态学变化Figure 2 IL-4 induces morphological changes in RAW264.7 cells

2.2 靛蓝最佳浓度的确定图3结果显示，0.004 ～4 μmol·L-1的靛蓝处理3 d 对巨噬细胞活力无明显影响。靛蓝浓度为40 μmol·L-1时，细胞存活率为（76.17 ± 11.04）%。而靛蓝浓度为400 μmol·L-1时，巨噬细胞存活率为（45.36±6.12）%，显著低于50%，表明该浓度靛蓝对巨噬细胞有明显毒性，故剔除该浓度。因此，优选0.4、4、40 μmol·L-13个浓度进行后续实验。

图3 不同浓度靛蓝处理3 d对RAW264.7细胞活力的影响Figure 3 Effect of different concentrations of indigo on the survival of RAW264.7 cells for three days

2.3 靛蓝对IL-4 诱导RAW264.7 细胞M1/M2 极化标志物的影响图4结果显示：IL-4诱导RAW264.7细胞3 d 后，Arg-1 的mRNA、蛋白表达水平较空白对照组显著升高（P＜0.001）；经4、40 μmol·L-1浓度的靛蓝干预后，Arg-1 的mRNA、蛋白表达水平均进一步升高，与IL-4 诱导组比较，差异有统计学意义（P＜0.001）。

图4 靛蓝对RAW264.7细胞Arg-1 mRNA、蛋白表达的影响Figure 4 Effect of indigo on mRNA and protein expressions of Arg-1 in RAW264.7 cells

图5 结果显示：IL-4 诱导RAW264.7 细胞3 d后，iNOS的mRNA表达水平较空白对照组显著下降（P＜0.001）；经0.4、4、40 μmol·L-1浓度的靛蓝干预后，iNOS的mRNA表达水平进一步下降，与IL-4诱导组比较，差异有统计学意义（P＜0.000 1）。

图5 靛蓝对RAW264.7细胞iNOS mRNA表达的影响Figure 5 Effect of indigo on the mRNA expression of iNOS in RAW264.7 cells

以上结果表明，IL-4 诱导RAW264.7 细胞M2极化模型构建成功。靛蓝可以上调M2 极化巨噬细胞标志物Arg-1 的转录、表达，抑制M1 极化巨噬细胞标志物iNOS 的转录。提示靛蓝可促进IL-4 诱导RAW264.7细胞向M2型极化。

2. 4 靛蓝对IL-4 诱导RAW264.7 细胞炎症因子表达的影响图6 结果显示：IL-4 诱导RAW264.7细胞3 d后，IL-10的表达水平显著升高（P＜0.05），TNF-α 的表达水平显著降低（P＜0.05）。0.4、4、40 μmol·L-1浓度的靛蓝均能进一步上调细胞IL-10的表达，并且能进一步下调TNF-α 的表达，40 μmol·L-1浓度靛蓝组与IL-4 诱导组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。表明靛蓝可发挥一定的抗炎作用。

图6 靛蓝对RAW264.7细胞IL-10、TNF-α蛋白表达的影响Figure 6 Effect of indigo on protein expressions of IL-10 and TNF-α in RAW264.7 cells

3 讨论

中药单体抗银屑病作用及其机制是目前的研究热点。已有许多关于单味中药板蓝根、大青叶、青黛治疗银屑病的网络药理学、动物、细胞层面的验证，均提示其具有良好的抗炎、抗增殖的效用[7-9]。靛蓝为上述药味的共同有效成分之一，阐明其在银屑病中的作用机制具有重要的研究意义。

RAW264.7 细胞是常用于制作炎症模型的巨噬细胞，可以通过不同的环境诱导分化成不同功能类型的细胞[10-12]。有研究验证20 ng/mL 的IL-4可以成功诱导RAW264.7细胞极化为M2型巨噬细胞（替代活化）[13]。M2 型巨噬细胞通过分泌IL-10、转化生长因子（TGF）-β 等细胞因子，参与细胞、组织抗炎及组织损伤的修复过程。在创伤愈合过程中，早期创面会产生M1 型巨噬细胞，促进创面的炎症反应，杀伤外来生物，随着炎症反应的发生发展，M1 型巨噬细胞会逐渐转变为M2 型巨噬细胞，促进创面的细胞增殖及血管形成[14]。但是，过度的M2 型巨噬细胞会导致细胞增殖过度、胶原蛋白沉积等促肿瘤作用[15]。

巨噬细胞本身具有高度的可塑性，可以在不同的组织中发挥特定的职能，也可以在固定的组织中随着微环境的改变而出现表型的变化[16-17]。根据巨噬细胞标志物表达水平的改变，可以推测出M1/M2平衡的改变。Arg-1、iNOS分别是M2、M1型巨噬细胞标志物，本研究采用IL-4诱导RAW264.7细胞，同时使用不同浓度（0.4、4、40 μmol/L）的靛蓝干预3 d，结果显示，与空白对照组或模型组比较，靛蓝3 个浓度组Arg-1 mRNA 及蛋白质的表达均有不同程度的升高，iNOS mRNA 表达显著降低。表明靛蓝可以调节M1/M2 型巨噬细胞平衡，使M2 极化状态下的巨噬细胞进一步向M2 方向极化。

IL-10 是具有抗炎特性的细胞因子，可以通过限制机体中各种免疫细胞对病原体的免疫反应，避免机体遭受损害[18]。TNF-α 是公认的促炎因子[19]。本研究结果表明，靛蓝可以抑制IL-4 诱导RAW264.7 细胞TNF-α 的表达，上调IL-10 的表达，提示靛蓝可抑制炎症反应，减轻银屑病炎症损害。

综上所述，本实验以治疗银屑病的常用中药板蓝根、大青叶、青黛等的共同有效成分靛蓝为实验药物，从巨噬细胞极化方面来探讨中药单体治疗银屑病的可能性，挖掘显示靛蓝可以通过促进巨噬细胞的M2 型极化在银屑病中发挥治疗作用。