甘肃太子山林区红桦和落叶松外生菌根真菌多样性研究

马尚志

（甘肃太子山国家级自然保护区管护中心，甘肃 临夏 731100）

外生菌根指植物根系与土壤真菌构建的互惠共生体，外生菌根在森林生态系统中广泛存在[1]，是森林生态系统中的重要组成部分。外生菌根真菌帮助植物吸收氮、磷等养分[2]，促进植物生长和改良土壤结构。已知的外生菌根有两万多种[3]，我国现存的外生菌根据报导有500多种。

落叶松和红桦树种具有早期速生、适应性强、材质优良等优势，在我国的荒山绿化、工业用材等应用中具有不可替代的重要作用[4]。针对甘肃太子山林区红桦和落叶松外生菌根真菌多样性的研究极为必要。选取分子生物学方法，开展甘肃太子山林区的真菌多样性的研究，为外生菌根真菌技术在甘肃太子山林区红桦和落叶松的人工造林提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 研究区域概况

甘肃太子山林区位于青藏高原和黄土高原过渡带，林地面积为8×104hm2，林区大部分地区属于山地，海拔高低不一，有针叶林植被、干草原植被、阔叶落叶林植被等不同类型植被。研究区域年平均温度为5℃左右，适宜栽培抗逆性强的树种。红桦和落叶松具有极强的耐寒性和耐旱性，具有较强的酸碱适应能力，适宜在该地域种植[5]。

1.2 样品采集

在甘肃太子山林区的红桦林和落叶松林进行采样，各选取2 个样地，每个样地分别随机选择25 株红桦与25 株落叶松，挖取样品的根系，研究各样品的外生菌根真菌的多样性。利用自封袋密封后带回至实验室，在温度为5℃左右的环境储存，共采集红桦与落叶松的根系样本共100份。

1.3 样品处理

将所采集的根系样品在自来水中浸泡数小时后，用孔径为400 μm 的土样筛进行清洗，将红桦和落叶松根系上的植物残体和土壤颗粒去除[6]。选取＜2 mm 直径的根系样本，剪成长度为1 cm的根段，通过显微镜观察红桦和落叶松根系的外生菌根的颜色、形状和大小，确定真菌品种，分析样品菌套表面特征以及质地。选取根段进行外生菌根的研究，对于老化的菌根需要及时去除，记录样品外生菌根未侵染的根尖数量以及外生菌根根尖数量。将外生菌根根尖依据形态特征分类，记录不同形态的外生菌根的根尖数量。

1.4 提取样品DNA

选取十六烷基三甲基溴化方法，提取样品外生菌根的DNA[7]。选取高通量组织破碎仪粉碎样品的外生菌根，设置破碎仪的振荡频率为2 000次/min。样品粉碎后，放入高速冷冻离心机中。完成离心处理后，加入400 μL的十六烷基三甲基溴化溶液，继续粉碎外生菌根。将离心处理后的样品，放入温度为70℃的水浴锅，水浴60 min 后，加入400 μL 的CIA溶液后，大力振荡萃取。将通过离心处理获取的上清液，转移到离心管内。去除离心管内的上清液，剩余样品进行干燥处理，提取样品的DNA，将所提取的DNA 置于30 μL 的去离子水内，作为检测样本。

1.5 DNA序列分析

选取华大基因组研究中心有限公司的序列分析试剂盒，对DNA 样本进行测序。将测序获取的ITS 作为样品的靶序列，在GenBank 数据库内搜索该序列的同源序列，挑选与样品形态型序列相近程度最高的参考序列，对外生菌根真菌与系统发育分析结合，鉴定红桦和落叶松外生菌根真菌。选取＞96%的序列相似性，设置为一个种类。

1.6 数据分析

1.6.1 优势度与优势类群

红桦和落叶松外生菌根的真菌物种优势度，利用重要值表示。重要值由外生菌根真菌的相对频度和相对多度之和组成，外生菌根真菌重要值越高时[8]，该物种具有更高的优势度。

外生菌根真菌物种的相对多度的计算公式如下：

被检测的外生菌根真菌样本数量＜25%时，设置该外生菌根真菌为稀有种；被检测的外生菌根真菌样本数量≥25%时，设置该外生菌根真菌为常见种；被检测的外生菌根真菌样本数量≥75%时，设置该外生菌根真菌为优势种。

1.6.2 外生菌根真菌多样性

选取α 多样性检测方法，检测红桦和落叶松外生菌根真菌的多样性。

外生菌根真菌的Simpson优势度指数计算公式如下：

外生菌根真菌的Shannon多样性指数计算公式如下：

外生菌根真菌的Pielou均匀度指数计算公式如下：

外生菌根真菌的Jaccad相似性指数计算公式如下：

外生菌根真菌的Sorenson相似度指数计算公式如下：

式中：Pi与S分别表示菌根的相对重要值以及研究区域每个样地检测出的菌根菌种类数；a与b分别表示样地与样地检测的菌根菌种类别数量；j表示研究区域的不同样地检测的共同菌根菌种类别数量。

1.6.3 真菌侵染率

真菌侵染率计算公式如下：

2 结果与分析

外生菌根真菌多样性指外生菌根群落中的真菌种类的多少，多样性是衡量真菌群落规模的重要指标。外生菌根真菌的分布越均匀，真菌种类越多时，外生菌根的真菌具有更高的多样性指数。土壤条件、地理条件等因素对外生菌根真菌的侵染率存在显著影响。针对红桦外生菌根真菌多样性和落叶松外生菌根真菌多样性，分别进行研究。

2.1 红桦外生菌根真菌多样性

甘肃太子山林区红桦外生菌根真菌重要值排名前五的分别为青霉、拟青霉、毛霉、犁头霉以及毛壳菌，其重要值分别为15.1%、12.5%、10.5%、8.5%以及5.8%。

红桦外生菌根真菌多样性指数结果见表1。

表1 红桦外生菌根真菌多样性指数Tab.1 Diversity index of ectomycorrhizal fungi of Betula albo-sinensis

通过表1 试验结果可以看出，甘肃太子山林区的2 个样地的红桦外生菌根真菌多样性的丰富度指数、Shannon 多样性指数等众多参数，均存在明显的差异。样地2 的各项多样性指数均明显高于样地1。表1实验结果说明，样地2的红桦外生菌根真菌多样性高于样地1。样地1 与样地2 两个样地的Jaccard指数为0.29，对比结果表明，甘肃太子山林区样地1与样地2的红桦外生菌根真菌存在较低的相似度。进一步分析研究区域的红桦外生菌根真菌多样性，30 a 生的中龄红桦外生菌根真菌的多样性明显低于15 s 的幼龄的红桦外生菌根真菌，表明红桦的树龄对外生菌根真菌的多样性存在一定的影响。样地2 的外生菌根真菌侵染率高于样地1 的侵染率，样地2 中多为幼龄红桦林，再次验证幼龄红桦树种，更容易受到侵染，形成外生菌根。

2.2 落叶松外生菌根真菌多样性

甘肃太子山林区落叶松外生菌根真菌重要值排名前五的分别为青霉、茎点霉、轮枝孢、犁头霉以及指轮枝孢，其重要值分别为14.5%、11.5%、9.8%、8.9%以及6.3%。落叶松外生菌根真菌多样性指数结果见表2。

表2 落叶松外生菌根真菌多样性指数Tab.2 Diversity index of ectomycorrhizal fungi of Larix gmelinii

通过表2 实验结果可以看出，甘肃太子山林区的两个样地的落叶松外生菌根真菌多样性的丰富度指数、Shannon 多样性指数等众多参数同样存在明显的差异。样地2的各项多样性指数均明显高于样地1。表2实验结果说明，样地2的落叶松外生菌根真菌多样性明显高于样地1，同时分布均匀性高于样地1。样地1 与样地2 的两个样地的Jaccard 指数为0.37，对比结果表明，样地1 与样地2 的落叶松外生菌根真菌存在较低的相似度。进一步分析研究区域的红桦外生菌根真菌多样性，样地2的落叶松外生菌根真菌多为阳坡，表明阳坡的落地松外生菌根真菌多样性高于阴坡。表2实验结果表明落叶松外生菌根真菌的多样性，受坡向影响。甘肃太子山林区的落叶松样地2 的外生菌根真菌侵染率高于样地1 的侵染率，样地2的落叶松外生菌根多为阳坡，因此更容易受到侵染，形成外生菌根。

以上试验结果可以看出，甘肃太子山林区的红桦和落叶松外生菌根真菌多样性指数较高，表明甘肃太子山林区的红桦和落叶松外生菌根真菌资源极为丰富，同时分布较为均匀。红桦和落叶松外生菌容易受到土壤条件、季节等众多因素影响，本文重点研究了树龄以及坡向对外生菌根真菌种类数量的影响，二者对外生菌根真菌多样性均存在影响。对比红桦和落叶松外生菌根的真菌多样性，甘肃太子山林区的红桦外生菌根的真菌多样性优于落叶松的外生菌根的真菌多样性。环境对树种外生菌根的形成有着一定影响，幼龄以及阳坡的树种，容易被外生菌根侵染，其真菌多样性更高。

3 结语

由于外生菌根的子实体容易受到破坏，同时外生菌根的真菌存在一定的分散性，所采集的样品可能并未采集到部分类别的真菌，甘肃太子山林区的红桦和落叶松外生菌根真菌的种类可能更加丰富。将对相同林区不同季节的外生菌根真菌多样性进行详细地调查与分析。外生菌根真菌多样性的研究，对于研究区域的育苗造林、恢复森林生态系统以及林区改造等应用，具有重大的研究意义及广阔的发展前景。