奎屯垦区棉花高效防病菌肥的研究

丁荣荣，史应武，刘志中，王国平，王海娟

（1.新疆生产建设兵团第七师农业科学研究所，新疆维吾尔自治区 奎屯 833200；2.新疆农业科学院微生物应用研究所，新疆维吾尔自治区 乌鲁木齐 830091）

2021 年我国棉花种植面积302.81×104hm2，棉花总产量573.1×104t，新疆地区棉花种植面积为250.61×104hm2，产量为512.9×104t，占全国棉花总产量的89.50%[1]。黄萎病（Verticillium dahliaKleb.）已成为新疆棉花生产中最重要的病害之一，严重阻碍新疆棉花产业的可持续发展[2]。棉花黄萎病属土传性病害，缺乏有效的药剂防治，在植物根际（根表面、根内部、根际土壤）生活着大量微生物，包括藻类和原生动物、细菌、放线菌、真菌等，它们参与植物生长全过程，推动土壤生态系统中的物质循环和能量流动，参与土壤中N、P、C、S 等元素的循环和有机质的分解，可作为土壤肥力的指标之一。不同植物有特定的根际微生物群落，定殖在植物的根际，与植物相互作用，直接或间接地影响植物的生长发育。因此，根际微生物群落构成了植物的第二基因组。

植物根际促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是一类生活在土壤或附生于植物根系，促进植物营养吸收与生长，并能够抑制有害生物的有益微生物。PGPR 是微生物肥料重要的种质资源，在绿色有机食品生产、生态保护以及农业可持续发展中都发挥着重要作用。根际促生菌的种类及其功能较多，其主要种类包括芽孢杆菌属（Bacillus）和假单胞菌属（Pseudomonas）等能合成生长素、赤霉素等，促进植物细胞生长、分裂分化、调节生根等，对植物生长发育有直接作用功能的物质，还可以改变土壤中磷、钾等元素的形态，使之有效化且利于植物吸收。研究还发现接种特定菌株于植物并种植，能产生吲哚乙酸（IAA）并含铁细胞等物质，植物的叶片数、根鲜质量、茎鲜质量、根干质量、茎干质量、根长、总生物量均有不同程度的增加。根际促生菌（PGPR）能够帮助植物获得营养物质、调节激素水平并抵抗病原微生物侵袭。近年来，关于微生物肥料的研究我国呈现出增长趋势，但是北方土壤中根际促生菌（PGPR）的研究较少。在环境污染日趋严重、生物多样性受到严峻威胁、众多科学家致力于发展生态农业的今天，棉花根际微生物与内生菌对棉花病害和产量的促进增产突显重要意义。

1 WJP-7摇瓶工艺研究

选用项目前期从新疆棉田分离出的一株高效无机磷分解菌Pseudomonas taiwanensis WJP-7，本试验拟通过正交设计试验探究菌株WJP-7培养基对发酵效果的影响，挖掘台湾假单胞菌WJP-7的施用价值。

1.1 材料

1.1.1 供试菌种

WJP-7（Pseudomonas taiwanensis）从新疆棉田自行筛选的菌剂。

1.1.2 供试培养基

初始种子培养基：蛋白胨5 g/L、氯化镁5 g/L、硫酸钾0.75 g/L，pH值自然，121℃，20 min。

1.1.3 试验试剂

试验试剂及其生产厂家见表1。

表1 试验试剂情况Tab.1 Test reagent status

1.1.4 实验仪器

超速离心机（Eppendorf 5417R）、恒温水浴锅（CS501-SP）、微波炉（HR-7751MS）、高压蒸汽灭菌锅（MLS-3020）、超净工作台（BHC-1300A/B3）、恒温培养箱（LRH-150-G，LRH-250A）、恒温摇床（ZHW211B）、pH 仪(pB-10)、精密电子天平（BS210S，BS4000S）、分光光度计（752N）、生化培养箱（LRH-250A）、移液器（eppendorf）等仪器设备由新疆农科院微生物应用研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 菌种的活化

将斜面保藏菌种在活化培养基斜面上划线后，于35℃培养箱中培养24 h，连续活化3代。

1.2.2 菌株种子培养液的制备

用接种环挑取完全培养基上的菌体与5 mL 无菌水制成菌悬液，接种于装有50 mL 种子培养基的250 mL 三角瓶中，置于35℃、180 r/min 的往复式摇床振荡培养，使其达到对数生长期。

1.2.3 菌株增菌培养液的制备

将培养好的种子液以1%的接种量转入装有50 mL 发酵培养基的250 mL三角瓶中，于35℃、180 r/min培养36 h。

以蛋白胨、氯化镁、硫酸钾为单因素，采用三因素三水平L9（33）的正交试验方法，对其培养基的重要组分进行考察，分析硫酸钾、氯化镁、蛋白胨对菌株生长的影响。三因素水平见表2，三因素三水平正交见表3。

表2 三因素水平表Tab.21 Three factor level table

表3 三因素三水平正交表Tab.3 Three-factor and three-level orthogonal table

1.2.4 菌体生长测定

取1 mL 增菌培养液，摇匀，用UV-2550 型分光光度计，1 cm光程600 nm测定OD值。

1.3 结果

微生物的一切生命活动都离不开其生长的环境。微生物从培养基中吸取各种营养物质，用于合成细胞物质、维持新陈代谢和产生代谢产物。增菌培养的目的是为了使菌体大量扩增，以获得足够数目、生长活力强的菌体。

在这3 种因素中，显著性结果为：蛋白胨>氯化镁>硫酸钾，其中蛋白胨高度显著。经试验后确定各因素的最优水平为A3B3C2，硫酸钾、蛋白胨、氯化镁的用量对应分别为1.4 g/L、20 g/L、15 g/L。也就是说A3B3C2 即为培养WJP-7 菌株的最佳培养基配方。优化后活菌数可达3.6×109CFU。

1.4 大田试验

1.4.1 试验地概况

2021 年4 月—9 月在奎屯垦区胡杨河市130 团8 连的试验地开展。试验地面积约9 hm2。4 月28 日播种，种植不抗病的新陆早16号，检验菌肥的效果。试验区田间管理等与对照相同。4 月28 日播种，4 月29 日滴出苗水。全生育期浇水10 次，6 月6 日滴头水，每隔7~10 d 滴1 次水。其他栽培管理同大田生产相同。

1.4.2 试验设计

采用小区试验随机排列，共设3个处理，处理1（T1）：滴施35×108CFU/mL WJP7 水剂5.0 kg/667 m2；处理2（T2）：滴施70×108CFU/mL 芽孢杆菌可湿性粉剂2.0 kg/667 m2；处理3（CK）：对照，滴施清水。每个处理面积1 hm2，重复3次。

1.4.3 调查项目及方法

采用五点取样法，选择试验小区具有代表性5 个取样点，每个取样点连续调查30 株棉花，在花期、吐絮期去调查棉花黄萎病发病株数。黄萎病病情分级参照国家标准（GB/T 22101.5-2009）中分级法，计算病株率和病情指数。棉花黄萎病分级标准[3-6]：0级，健株；1级，病株叶片有25%以下叶片显症；2 级，病株叶片有25%~50%表现病状；3 级，病株叶片有50%以上叶片显症；4 级，全株叶片发病，干枯脱落成光秆或急性萎蔫死亡。

病情指数=∑（级值×株数）/（最高级值×总株数）×100%；防治效果=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100%。每个处理选择有代表性的样点5个，每点标记棉株20株，测定棉花平均单铃质量，计算产量。

1.4.4 菌剂田间试验不同处理对棉花黄萎病的防治效果

不同处理黄萎病的病情指数分别是2.25、1.02 和4.83，其中施用70×108CFU/g 枯草芽胞杆菌可湿性粉剂处理的棉花，黄萎病病情指数最低，35×108CFU/mL WJP-7 水剂和70×108CFU/g 枯草芽胞杆菌可湿性粉剂处理对花期黄萎病防效分别为43.22%和72.21%，絮期防治效果分别为50.23%和60.12%。

2 发酵罐工艺研究

2.1 材料与方法

2.1.1 供试菌种

WJP-7（Pseudomonas taiwanensis）。

2.1.2 供试培养基

菌体发酵培养基采用已优化的培养基。

2.1.3 主要试剂与设备

主要试剂见1.1.3；设备：10 L 自控发酵罐，德国贝朗，发酵液溶氧自动指示，温度自动控制，pH值自动控制。

2.1.4 菌体干质量与OD600关系

将洗净且烘干的离心管称质量，得离心管的空质量为W0。取10 mL 不同吸光度值的发酵液置于离心管内，于转速10 000 r/min 离心15 min，弃去上清液，所得湿菌体用生理盐水洗涤两次。将离心收集到的菌体于80℃烘干至恒质量，称量后得菌体及离心管质量，记为W1，两者质量之差（W1-W0）即为菌体干质量。按此方法测定菌体干质量，以吸光值OD600为横坐标，菌体干质量为纵坐标绘制吸光度与菌体干质量间的关系曲线。回归方程为Y=15.808X-0.409 1，R2=0.9987，说明线性回归比非常显著，故可用OD600的大小表示菌体的生长情况。

图1 吸光度与菌体干质量间的关系Fig.1 The relationship between absorbance and dry mass of bacteria

2.1.5 培养条件

建立从摇瓶到10 L 发酵罐的二级发酵工艺。将摇瓶种子液按10%的接种量接入10 L 发酵罐中，装液量6 L，pH 值为7.2，温度为35℃，初始转速400 r/min。

2.2 试验结果

本课题对WJP-7 在10 L 全自动发酵罐发酵过程进行了研究。分析了搅拌转速和pH对菌体量的影响。

2.2.1 搅拌转速对WJP-7增菌发酵的影响

在发酵罐试验中通过保证通风量和罐压不变的情况下，分别在不同转速条件下，观察了菌体的生长、溶氧变化的影响。

通过对WJP-7在10 L全自动发酵罐中300 r/min、500 r/min和700 r/min的不同转速条件下分批发酵试验，得出WJP-7在10 L罐中WJP-7溶氧变化趋势、菌体生长曲线。

不同转速的发酵过程中，溶氧变化趋势相似。发酵初期，属于菌体生长阶段，对氧需求量较大，溶氧下降较快，转速越小，溶氧下降速率越快；发酵中期，溶氧只用来维持菌体正常生理需求，其保持相对稳定；发酵后期，随着营养物质的耗尽，菌体开始逐渐死亡，耗氧量下降，溶氧回升。

在不同转速条件下，菌体生长量都能达到一个相同的饱和值，但菌体的生长速度不一样，且转速为500 r/min时，菌体的生长速率最快，32 h 达到饱和值，而过高的转速导致溶氧过高，反而对菌体生长相对缓慢，600 r/min 时达到饱和浓度的时间为34 h，转速为400 r/min 时44 h 菌体生长达到饱和值。提高搅拌转速能明显提高细胞生长速度。

2.2.2 pH值对WJP-7增菌发酵的影响

根据摇瓶过程中pH 值的变化情况，在发酵过程中通过用浓氨水自动调节pH 值分别为7.0、7.2、7.5。在发酵过程中pH 值对许多酶的催化过程和许多细胞之间的特性传递过程有很大的影响，pH 值的变化能改变体系的酶环境和营养物质的代谢流，使得诱导物和生长因子在活性和非活性之间变化。结果表明，pH 值对菌体生长量的影响不大，pH 值分别为7.0、7.1、7.2 对应细胞干质量分别为13.28 g/L、13.69 g/L、12.91 g/L。因此，实验确定发酵过程中控制最适pH值为7.2。

3 结语

在摇瓶种子培养的基础上，对WJP-7进行了10 L发酵罐工艺研究，确定10 L 种子罐最佳工艺参数为：装液量为6 L，转速500 r/min，pH 值为7.0~7.2，35℃，调整转速使溶氧维持在30%以上，菌龄32 h。WJP-7 水剂2 种处理对棉花黄萎病防治效果分别为50.23%，60.12%，比对照清水防效显著。