饲料中添加复方中草药对美国牛蛙生长性能、血清生化指标和肠道组织形态的影响

■ 杨旭红 黄 凯* 黄明磊 夏乐文 林向东 于 凯 郭睿婕 黄 娇

（1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004；2.吉林酉盛达农业科技有限公司，吉林白山 134300；3.南宁海宝路水产饲料有限公司，广西南宁 530031）

美国牛蛙（Lithobates catesbeiana）俗称牛蛙，属于两栖纲（Amphibia）、蛙科(Ranidae)，原产于北美洲，因其肉鲜味美、生长迅速，牛蛙养殖业在我国中南部快速发展。2013 年以来，牛蛙养殖年产量达15 万吨以上[1-2]。然而，在高密度集约化养殖下，出现牛蛙生长速度慢、饲料利用率低及对细菌病毒抵抗能力弱的情况。为提高牛蛙生长性能及防治病害，以抗生素为主的各种药物开始在养殖过程滥用，引发了社会对养殖牛蛙安全性的忧虑。近年来，许多的研究表明中草药在养殖上具有显著的优势和功能[3-5]。研究发现，在鞍带石斑鱼（Epinephelus lanceolatus）饲料中添加2 g/kg复方中草药能提高生长性能和消化酶活性[4]。目前，中草药在畜禽上也有应用。研究表明添加1.0%的复方中草药可改善山东麻羽绿壳蛋鸡（Green-eggshellLaying Hens）的生产性能和蛋品质[5]。在饲料中添加中草药能提高养殖动物自身的免疫能力，减少常规抗生素、化学药等渔药的使用，在促进鱼类的健康生长同时，又能提升水产品质量安全水平。

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蒲公英为菊科蒲公英，属多年生草本植物，富含矿物质、维生素等营养成分。能够清热解毒、抗菌消炎，提高机体免疫[6-7]。青果又名橄榄，是橄榄的干燥成熟果实，含有丰富的生物活性物质，具有清热解毒、抗菌消炎、抗氧化作用[8]。败酱草，又称苦菜等，隶属于败酱科多年生草本植物。具有祛瘀止痛、清热解毒、保肝利胆等功效[9]。罗摩是可食用的攀援草本植物，富含类固醇、多酚和黄酮醇衍生物，具有广谱抗菌活性和显著的抗氧化作用[10]。葡萄籽是原花青素的丰富来源，该化合物具有抗氧化、抗炎、免疫刺激、抗病毒和抗血栓等有益健康的作用[11]。我国的中草药资源丰富且安全，目前，关于中草药的报道大多在鱼类、畜禽上[3，12-13]，在两栖类动物上进行试验的报道很少。因此，本试验将蒲公英、青果、败酱、罗摩、葡萄籽5 种中草药按一定配比混合制作成的复方中草药，替代常规的抗生素，以研究其对美国牛蛙生长性能、血清生化指标、肠道消化酶和肠道组织形态的影响，为该复方中草药在生产中的应用提供理论依据。

1 试验材料与方法

1.1 试验设计及饲养管理

试验蛙苗购于广西柳州某牛蛙养殖场。饲养试验在广西大学水产试验基地进行。试验开始前暂养2 周，暂养结束后，停喂24 h，挑选出体质健康、规格均匀的牛蛙600只。试验牛蛙初始体重为（7.87±0.16） g。随机分为5 组，每组设3 个重复，每个重复放置40 只牛蛙。饲喂以鱼粉为蛋白源配制基础饲粮。分别在基础饲粮中添加0、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%的复方中草药，制作5种等氮等能的试验饲料（标记为DC组、DC 0.25组、DC 0.50组、DC 0.75组、DC 1.00组）。饲料差额部分采用微晶纤维素补充。基础饲粮组成及营养水平见表1。根据饲料配方，原料经粉碎、混匀、过60 目筛后，用饲料膨化机制成直径为2.5 mm 的浮性饲料。试验期为90 d，饲喂时间为09：00和17：00。养殖期间水位为60～80 cm，水温为（25±3） ℃。

表1 基础饲粮组成及营养水平（干物质基础，%）

1.2 试验材料

试验使用的复方中草药是以蒲公英（15 g）、青果（20 g）、败酱（15 g）、罗摩（10 g）、葡萄籽（30 g）作为原材料，采用植物因子萃取方法在吉林酉盛达农业科技有限公司的生产车间进行提取，再按一定比例配比后，经冷冻抽干等工艺制备而成。

SIGMA 1-14 高速离心机，德国SIGMA 公司；BCD-256WDGK 冰箱，青岛海尔股份有限公司；9FQ30-20 饲料粉碎机，上海奥然科贸有限公司；MS-105 电子天平，梅特勒·托利多仪器（上海）有限公司；ELx800酶标仪，Bio-TeK 宝特；FYL-YS-50L电热恒温箱，北京福意联冷藏设备有限公司；SLG-70 挤压膨化机，山东佳伟机械设备有限公司。

1.3 样品采集

饲养试验结束后，对美国牛蛙禁食24 h 处理，每个养殖池随机取12只牛蛙。其中6只用于生长指标的测定。3只牛蛙活体置于-80 ℃冰箱，用于全蛙组成分分析。3只牛蛙采用双毁髓法处理，用1 mL的注射器抽取血液注入1.5 mL的离心管中，4 ℃冰箱静止24 h，之后离心10 min（3 000 r/min，4 ℃），分离取得血清，置于-80 ℃冰箱保存，用于生化指标测定；解剖后取肠道组织，用生理盐水清洗后，一部分置于-80 ℃冰箱保存，用于肠道消化酶测定，另一部分放入4%预冷的多聚甲醛固定液中，用于肠道形态分析。

Wf——牛蛙终末体质量（g）；

1.4 指标测定

1.4.1 常规营养成分测定

水分含量采用105 ℃恒温干燥失重法测定（GB/T 5009.3—2016）；粗灰分含量采用550 ℃马弗炉灼烧法测定（GB/T 5009.4—2016）；粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定（GB/T 5009.5—2016）；粗脂肪含量采用索氏抽提法测定（GB/T 5009.6—2016）。

1.4.2 血清生化指标和肠道消化酶测定

Ni——初始蛙数；

由表4 可知，各试验组间水分含量无显著差异（P＞0.05）；DC 组粗蛋白含量显著高于DC 0.25、DC 0.75、DC 1.00 组（P＜0.05），与DC 0.50 组无显著差异（P＞0.05）；DC 0.25、DC 0.75 组粗灰分含量显著高于DC、DC 0.50、DC 1.00组（P＜0.05）。DC组粗脂肪显著高于DC 0.25、DC 0.75 组（P＜0.05），与DC 0.50 组、DC 1.00组无显著差异（P＞0.05）。

1.4.3 肠道形态分析

肠道组织采用4%预冷多聚甲醛固定24～48 h，经水洗、脱水、透明、石蜡包埋等步骤后，制作5 μm厚切片，置于切片盒中，保存备用。H.E.染色参照许波[14]染色方法。显微镜下观察肠道组织的形态特征。

1.5 计算公式

增重率（WGR,%）=（Wf-Wi）/Wi×100

特定生长率（%/d）=（lnWf-lnWi）×100/t

饲料系数（FCR）=W0/(WfNf-WiNi+Wd)

目前，干旱灾害已成为影响我国农业生产和粮食安全的主要因素之一，我国每年因干旱灾害造成的粮食损失约占各种自然灾害损失总量的60%。淮河流域面积约为27万km2，主要涉及河南、安徽、江苏和山东四省，是我国重要的粮、棉、油产地和能源基地。同时，淮河流域属于资源性严重缺水地区，人均水资源量、亩均水资源量分别处于全国十大水资源评价片中的第9位和第8位，水资源不足导致的干旱灾害已成为制约流域内农业乃至社会经济发展的瓶颈。

肥满度(CF，g/cm3)=Wf/L13×100

2）价格昂贵、维护成本高。高校用于科研的大型仪器设备品质精良，价格昂贵。例如：美国Precitech公司的纳米精密车铣复合机床Nanoform X约290万元/台套；FIE公司的聚焦离子电子双束系统Small dual beam是500多万元/台套，单个镜头的最低价格十几万元，维保费近30万元/年。这些仪器设备精度高，对环境要求也高。例如：大型重载装备需要构筑减振地基；纳米级制造装备及测量仪器需要恒温、无尘，具备万级净化间标准环境；OLED柔性电子薄膜封装实验不仅需要恒温、无尘，还需要真空环境等。

肝体比（HSI，%）=100×Wh/Wf

企业合并重组后，其成本支出将在短期内增加。造成这一问题的原因主要有两个方面。首先，合并企业的经营范围通常会存在一定的交集，因此其生产要素会部分重叠。在合理整合这部分生产要素前，企业必然会为其支付相应的开支。其次，合并重组后新企业的内部管理将进入磨合期，在这一过程中，企业的要素流转效率将进一步下降，其运营成本也将相应提高。总之，合并重组将改变企业的资源配置与运营结构，常态环境下的财务管理机制难以对各环节进行有效评价。

式中：Wi——牛蛙初始体质量（g）；

Where: ra is armature winding; rf is excitation winding;rD is direct-axis damping winding;rQ is cross-axis damping winding; w is electrical angular velocity of rotor.

W0——每个养殖箱中所投喂饲料总量（g）；

Wd——终末每个养殖箱死亡牛蛙体质量（g）；

Nf——终末牛蛙数；

根据冲片工艺要求，提出模具设计思路：在复试落料模的基础上，增加可换位键槽凸模模块，相邻两个换位键槽的夹角设计为90°。模具工作时，第一张冲片键槽位于Y轴正方向，第二张冲片键槽位于X轴正方向，第三张冲片键槽位于Y轴负方向，第四张冲片键槽位于X轴负方向……(图1)，如此实现循环换位冲制。冲片压装时，相邻的两张冲片相差90°，避免由于冲片板厚偏差而导致的质量问题。

一个转弯之后，王树林轻拍着方向盘说，还是老话说的好，老马识途，驾轻就熟。又觉得词不达意，补充说，就像这车，坐上来无需磨合，一摸就有。

存活率（SR，%）=Nf/Ni×100

t——试验天数（d）；

Wh——蛙肝脏重（g）；

Wv——蛙内脏重（g）；

L1——终末体长（cm）。

1.6 数据处理及分析

试验数据均采用Excel 和SPSS 26.0 软件进行统计分析，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）与Duncan’s 法多重检验进行比较，所有数据值均由“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著。

脏体比（VSI，%）=100×Wv/Wf

2 结果与分析

2.1 饲料中添加复方中草药对美国牛蛙生长性能的影响

由表2 可知，各试验组间增重率和特定生长率存在显著差异（P＜0.05），DC 0.25、DC 0.75 组显著高于DC、DC 0.50 组（P＜0.05）；DC 0.75 组的终末体重显著高于DC 组、DC 0.50 组（P＜0.05）；DC 1.00 组成活率显著高于DC、DC 0.25、DC 0.50组（P＜0.05）；各试验组饲料系数无显著差异（P＞0.05）。

ACL术前诊断多依靠影像学检查,但仅凭影像学诊断ACL困难。超声表现为肾上腺区域边界清晰的无回声包块[4]。CT表现为薄壁非实性非结节样组织，无明显强化。内容物低密度，无强化，有时可伴有出血[5]。磁共振显像较CT更为灵敏，表现为T1低信号，T2高信号，复杂型淋巴管瘤T1T2均为高信号[3]。ACL术前仍需与肾上腺皮质腺瘤、嗜铬细胞瘤、肾上腺单纯囊肿相鉴别。GAO等[6]建议其中具有嗜铬细胞瘤相关症状或者儿茶酚胺值显著升高且肿物直径大于4 cm的患者术前应用药物准备。

表2 饲料中添加复方中草药对美国牛蛙生长性能的影响

由表3 可知，各试验组间肥满度、肝体比和脏体比无显著差异（P＞0.05）。

表3 饲料中添加复方中草药对美国牛蛙形体指标的影响

2.2 饲料中添加复方中草药对美国牛蛙体成分的影响

谷草转氨酶（GOT）、谷丙转氨酶（GPT）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（T-CHO）、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛（MDA）、碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、肠道淀粉酶（Amylase）、胰蛋白酶（Trypsin）、脂肪酶（Lipase）采用试剂盒测定，测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所有限公司。

钱塘江流域耕地变化的时间趋势如图1所示。从图1中可以看出1999-2009年间钱塘江流域耕地面积总体上呈下降趋势。1999-2004年流域内耕地总面积减少了1.45%(7.4khm2)。这个规律与姚伟等人的研究成果相符(1985-2004年间钱塘江流域内各土地利用结构变化比较大，耕地水域和未利用地面积在减少[6])。2005-2006两年内，流域内耕地总面积有所增加，这与土地整理以及耕地保护政策的实施有关。2007-2009年因经济发展、城市化进程加快占用了大量耕地， 2007年开始，耕地面积快速减少，从2007-2009年减少了0.34%，净减少1.7 khm2。

表4 饲料中添加复方中草药对美国牛蛙体成分的影响（%）

2.3 饲料中添加复方中草药对美国牛蛙血清非特异性免疫指标和肠道消化酶的影响

由表5可知，DC 1.00组SOD含量显著高于DC组、DC 0.25 组（P＜0.05），与DC 0.50 组、DC 0.75 组无显著差异（P＞0.05）；DC 组MDA 含量显著高于DC 0.50、DC 0.75、DC 1.00组（P＜0.05），与DC 0.25组无显著差异（P＞0.05）；DC、DC 0.25 组GPT 含量显著高于DC 0.50、DC 0.75、DC 1.00组（P＜0.05）；DC组GOT含量显著高于DC 0.25、DC 0.50、DC 0.75、DC 1.00组（P＜0.05）；DC 1.00组ACP、AKP含量显著高于其他4组（P＜0.05）；DC组TG含量显著高于其他4组（P＜0.05）；DC 1.00组、DC 0.75组含量显著低于DC组、DC 0.25组、DC 0.50组（P＜0.05）。

表5 饲料中添加复方中草药对美国牛蛙血清生化指标的影响

由表6 可知，DC 1.00 组和DC 0.75 组蛋白酶显著大于DC 0.50 组、DC 0.25 组和DC 组（P＜0.05）。各组间脂肪酶含量无显著差异（P＞0.05）。DC 1.00 组淀粉酶含量显著高于DC 0.25、DC 组（P＜0.05）；与DC 0.75、DC 0.50组无显著差异（P＞0.05）。

表6 饲料中添加复方中草药对美国牛蛙肠道消化酶的影响

2.4 饲料中添加复方中草药对美国牛蛙肠道形态的影响

由表7 可知DC 1.00 组绒毛高度显著大于DC、DC 0.50、DC 0.75 组（P＜0.05），与DC 0.25 组无显著差异（P＞0.05）。各组间绒毛宽度无显著差异（P＞0.05）。DC 1.00 组肌层厚度显著大于DC、DC 0.25、DC 0.5 组（P＜0.05），与DC 0.75 组无显著差异（P＞0.05）。各组间肠上皮细胞高度无显著差异（P＞0.05）。肠道组织切片图1 显示，黏膜下层和固有层无断层，肠壁较厚，肠绒毛密而粗壮，末端无破损，肠绒毛上皮细胞间可观察到较多杯状细胞。

图1 美国牛蛙肠道组织切片（H.E.染色，200 μm）

表7 饲料中添加复方中草药对牛蛙肠道形态的影响(μm)

3 讨论

3.1 饲料中添加复方中草药对美国牛蛙生长的影响

中草药作为一种新型的绿色饲料添加剂，其含有的营养和生物活性物质，能加快机体代谢和蛋白质合成，从而提高生长性能[15]。Mostafavi 等[16]研究发现，3 g/kg 的蒲公英花提取物，可显著提高虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）的生长性能。高学政等[17]在饲料中添加复方中草药饲喂大菱鲆（Scophthalmus maximus Linnaeus），降低了饲料系数，提高了特定生长率。本试验发现，饲料中添加复方中草药可以提高美国牛蛙存活率和特定生长率。在黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）研究中发现，饲喂含有2%复方中草药其增重率和存活率却显著低于1%组[18]。相似的结果在花鲈（Lateolabrax japonicus）上也发现[19]。在本试验中也发现，高剂量复方中草药会导致特定生长率和增重率下降，可能是中草药导致机体过度免疫反应, 从而消耗更多的能量。此外，本试验结果还显示，饲料中添加复方中草药对美国牛蛙的脏体比、肝体比和肥满度并无显著影响。这与复方中草药在影响大菱鲆和鞍带石斑鱼肥满度的研究结果有所不同[4，17]，推测可能是所研究的试验对象不同导致。

3.2 饲料中添加复方中草药对美国牛蛙体成分的影响

蛋白质和脂肪的含量直接体现了动物体的营养价值。本试验饲料中添加复方中草药对牛蛙的水分没有影响。且随着添加水平升高，粗蛋白和粗脂肪含量开始降低，其中0.75%和0.25%粗灰分含量显著高于其他组。马玲巧等[20]在施氏鲟（Acipenser schrencki）饲料中添加复方中草药发现，0.5%组肌肉粗蛋白含量显著高于对照组、1%和2%组，试验组粗灰分含量显著高于对照组，这与本试验结果相似。Tan 等[21]在鲳鱼（Trachinotus ovatus）饲料中添加蒲公英根提取物发现，随着添加水平的升高能够提高全鱼的粗蛋白含量和水分含量，降低粗脂肪含量。这与本试验结果又有所出入，这也说明中草药具有提高机体营养的作用，但其作用可能与中草药添加量、试验对象等因素相关。

3.3 饲料中添加复方中草药对美国牛蛙血清非特异性免疫指标和肠道消化酶的影响

血清指标一定程度揭示了机体内环境稳定及营养代谢正常与否的综合指标[22-23]。SOD 反映的是机体抗氧化能力的强弱，能够消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质[24]。MDA 是膜脂过氧化的最终分解产物，可间接反映出细胞受氧化损伤的程度[25-26]。卢世杰等[5]研究表明，在日粮中添加复方中草药剂可提高绿壳蛋鸡抗氧化性能，降低脂质过氧化损伤。且在添加量为1%效果最好。但胡斌[27]在研究大口黑鲈（Micropterus salmoides）幼鱼时发现复方中草药Ⅲ（辣蓼、青蒿、苍耳草、赤小豆、苦杏仁、麦麸、面粉）降低了鱼体抗氧化的能力，同时MDA 含量增加，加大肝脏病变风险，推测是药物之间相互作用使得氧自由基处于活跃状态导致。本试验结果发现，SOD 含量随着复方中草药的添加水平上升而上升，MDA 含量与之相反。这也说明了饲料中添加复方中草药对牛蛙提高抗氧化能力和抵御细胞损伤有一定的作用。

Brovey变换可以提高多光谱影像的空间分辨率，同时也能保持影像的光谱特性，结果如图3所示。这种方法融合后影像色调非常好，几乎完整地保持了原始影像的色调信息，而且还可以增加影像直方图高低部分的比率，提供城市中阴影、水体和高反射地物的对比，因此它可以产生一幅更高程度反映影像直方图高低部分对比的RGB影像。虽然这种方法对多光谱影像的辐射信息有一定程度的改变，但经融合后，分辨率得到大大提高，地物更为突出，融合后的影像的细节纹理得到了明显增强，在颜色、色调上与原图保持了较好的一致性，既有丰富的影像信息，又能满足地理国情普查数据采集精度要求，还便于内业人工判读，减少外业核查工作量。

血清TG 和T-CHO 是机体脂质代谢指标，反映动物血清中脂质的含量[28-29]。牛小天等[29]研究发现蒲公英总黄酮能够降低大口黑鲈血液中的TC、TG含量。本次试验同样发现，随着饲料中复方中草药添加水平增加，血清中TG 和T-CHO 含量表现为下降趋势，说明通过复方中草药改善了美国牛蛙肝脏脂质代谢状况。血清GOT、GPT 主要存在于机体的肝和肾等组织细胞，反映了肝细胞损伤程度[30-31]。本试验发现，复方中草药添加水平增高使得血清GOT 含量和GPT 含量呈下降的趋势。证明复方中草药在养殖过程中有效降低牛蛙的肝脏负担，且添加量的增加并未导致肝脏负担增加。但在齐茜等[32]对板蓝根和甘草的复方研究出现相反的结果，同时也表明某些中药会对肝功能产生负面影响。AKP 是参与磷酸基团的转移和代谢，在免疫过程中发挥作用[33]。ACP 是巨噬细胞内溶酶体的标志酶，与细胞的消化代谢免疫调节有关[34]。在本试验中，AKP含量和ACP含量随着蒲公英的添加水平上升而增加。相似的结果在牙鲆（Paralichthys olivaceus）[33]和虹鳟[34]上发现。这也证明复方中草药在一定程度能促进美国牛蛙的免疫功能。

消化酶是指所有参与消化过程酶的总称。它能够将大分子物质分解成小分子物质从而有利于吸收，能反映机体消化能力的一项指标[35-36]。研究发现，饲料添加4%的刺五加超微粉可以显著提高吉富罗非鱼（Genetically improved farmed tilapia,GIFT）肠道消化酶(淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶)含量。饲料中添加1%复方中草药也能对杂交鲟肠道消化酶活性具有促进作用[26]。同样的结果，在大鳞副泥鳅（Paramisgurnus dabryanus）[37]、白 点 鲑（Salvelinus pluvius）和 亚 东 鲑（Salmo trutta fario）均有发现[38]。本试验结果也发现，在饲料中添加复方中草药能够显著提高美国牛蛙的肠道消化酶活性，增强美国牛蛙的消化功能。

良好的问题情境一起学生的情感体验，促使学生主动的构建知识，充分发挥学生的积极性、主动性和创造性，提高课堂教学效率。本案例以求的值的问题引入，情境简单、起点不高，但能有效的沟通学生的新旧经验，能够使学生产生兴趣，迅速地把精力集中到对重点问题——“如何求大角的三角函数值”的深入研究。

3.4 饲料中添加复方中草药对美国牛蛙肠道形态的影响

肠道是机体吸收营养物质的主要器官之一，其结构和功能的完整性与营养物质消化、吸收和转运密切相关[39-40]。一般认为肠绒毛高度和肠绒毛宽度增加有利于增大肠黏膜与食糜接触面积，有助于对营养物质的吸收，而肌层厚度则是影响着营养物质的转运速度[41-42]。Hu 等[43]在给肉鸡（Gallus domesticus）口服猪源抗菌肽发现，十二指肠和空肠绒毛高度均显著提高。陈福艳等[42]在罗非鱼（Oreochromis mossambicus）饲料中添加酵母多糖-中草药复合制剂，发现试验组肠道的绒毛高度和肌层厚度显著高于对照组。同样的，黄芪多糖也能提高雏鸡空肠绒毛高度/隐窝深度值[43]。本试验结果表明，试验组肠绒毛高度、肠绒毛宽度和肌层厚度相对于对照组具有不同程度的提升，与其在草鱼（Ctenopharyngodon idella）[44]、鲤 鱼（Cyprinus carpio）[45]、南亚野鲮（Labeo rohita）[46]上研究一致，也进一步说明中草药能够提高肠绒毛的高度与宽度、肌层厚度等。本研究还显示，添加量为0.75%的试验组最好，也得出复方中草药一定程度上增加小肠绒毛的表面积，更有助于美国牛蛙肠道对营养物质的吸收。

4 结论

综上所述，在饲料中添加复方中草药饲喂美国牛蛙90 d后不同程度提高了美国牛蛙特定生长率、增重率和存活率。提高了血清中SOD、ACP 和AKP 的含量，降低MDA、GOP、GPT、T-CHO 和TG 含量，提高了肠道消化酶的活性。通过肠道形态学发现，能够增加肠绒毛的表面积，增强机体对营养物质的吸收。综合生长、血清免疫指标、肠道消化酶和肠道形态学的变化以及饲料系数考虑，建议美国牛蛙最适复方中草药添加量水平0.75%。