光谱技术及电子感官系统在食源性致病菌无损检测中的应用

贺巧玲，曹敏，孙在兴，罗皓，李玉锋*

（1.西华大学，四川 成都 610039；2.四川省食品检验研究院，四川 成都 610000）

食源性疾病是最常见的疾病之一，已经成为世界性公共卫生问题，据世界卫生组织统计，每年由于致病微生物引起腹泻造成死亡人数超过220 万人，食品安全问题是关乎人民健康和社会福祉的大问题[1]。食源性致病菌的检测和分类对食品安全监测十分重要，许多细菌或可指示食品卫生标准，如大肠杆菌（Escherichia coli）；或直接导致食源性疾病，如致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙门氏菌（Salmonella）、单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes） 等。为加强对食品中微生物污染的监管，采用合适快速的检测方法和技术对食源性致病菌进行检测显得尤为重要。

食品中常见致病菌的传统检测法有多管发酵法、滤膜法和平板计数法，均为微生物培养法，需对食品样品进行预处理、增菌培养、分离培养、生化试验及血清学鉴定等。这些方法应用广泛、准确性高，但耗时较长、步骤繁琐，对操作人员有较高的操作要求。为提高检测效率、缩短检测时间，致病微生物的快速检测技术逐渐发展成熟，包括分子生物学检测技术、免疫分析检测技术、色谱学检测技术等，可快速对微生物进行定性和定量检测，但大多数快速检测方法仍需破坏食品样品进行预处理，因此，需要复杂的样品准备和专业操作。无损检测技术是一种可快速、准确检测食品中微生物的技术，对检测样品无破坏性，可在原位进行无损检测。

无损检测技术是在不破坏被检样品的前提下，运用各种物理学方法如声、光、电等对物料进行检测分析的一种方法和技术[2]。与传统检测方法相比，无损检测技术具备不破坏被检样品、检测速度快、少污染、可实现自动化等优势。常用于食源性致病菌检测的无损检测技术有近红外光谱、高光谱成像技术、拉曼光谱技术、电子感官技术、生物传感器分析技术。鉴于无损检测技术在食品微生物污染检测中的高实用性，本文介绍和分析了3 大无损检测技术（近红外光谱技术、高光谱技术和电子感官系统）的基本原理及其在食品常见致病菌检测中的应用，并介绍最近研究进展，为3 种无损检测技术在食品中的进一步应用提供参考。

1 近红外光谱技术

1.1 近红外光谱技术检测常见食源性致病菌的原理

近红外光是指位于780～2500nm（12820～4000cm-1）范围的电磁波，近红外光谱（near infrared spectroscopy，NIRs）技术利用物质对近红外光的选择性吸收及其吸收强度来预测其成分和含量，可对有机物质进行定性和定量分析[3]。NIRs 通过测量分子振动的倍频及合频吸收，读取微生物菌体细胞壁、细胞膜及细胞内生物大分子和水的化学键振动情况，获得整个微生物菌体生化组成成分的光谱定性定量信息，其中包含了绝大多数类型有机物组成和分子结构的丰富信息，以此区分微生物生化信息的差别进行鉴别[4-5]。由于倍频与合频吸收强度弱、吸收带较宽且重叠严重，导致NIRs 解析信息困难，在进行食源性致病菌的检测时必须结合化学计量学技术[6]。

1.2 近红外光谱技术无损检测常见食源致病菌的应用

NIRs 技术已广泛用于评估不同产品的微生物特性，如牛肉、猪肉、鸡肉、鱼、牛奶和果蔬等[7]。利用可见近红外光谱技术对新鲜生菜叶片中大肠杆菌污染进行无损检测和评价发现：在450～990 nm 波长范围内，可见光/近红外光谱分析技术可快速、准确地检测生菜中的大肠杆菌ATCC 8739[8]。以大肠杆菌和铜绿假单胞菌为研究对象，在4 000～10 000 cm-1范围内用近红外分析仪对2 种微生物数量不同的乳制品样品进行透过率测定，以探究近红外技术在乳制品行业微生物检测中的应用潜力，模型表明，在有微生物生长的牛奶样品中微生物的区分度较好[9]。栢凤女等[10]以近红外光谱法结合支持向量机对大肠杆菌O157∶H7、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌进行分类鉴定，以径向基函数为核函数的支持向量机在核参数为0.5 时对3 种食源性致病菌的鉴别效果最好，与国标方法相比结果一致，其鉴别准确率均达到100%。

NIRs 结合线性化学计量学方法是一种准确、方便的细菌分类工具。NIRs 的固有缺点为光谱响应中显著的多重共线性，因此，最好选择较少数量的波长进行模型建立，这样选择不仅可避免光谱多重共线性，且由于变量数量的减少，可显著减少模型的计算时间，使模型更易解读。对市售菠萝果肉中的大肠杆菌和肠炎沙门氏菌进行鉴定分类的研究中，采用主成分分析、软独立类类比建模分析和偏最小二乘判别分析3种方法，结合NIRs 技术进行试验，其中结合偏最小二乘判别分析法对大肠杆菌和肠炎沙门氏菌的预测能力分别达到87.5%和88.3%[11]。NIRs 结合偏最小二乘法可建立线性类边界模型，用于果肉中的细菌鉴别和检测。细菌生物被膜是食品工业卫生问题和经济损失的主要来源，一项研究评估了基于可见光、近红外和短波红外光谱的技术对快速检测金黄色葡萄球菌在聚苯乙烯上形成生物膜有效性，该研究为后续开发基于光谱学的协议奠定基础，该协议允许在食品工业表面进行生物膜检测[12]。试验结果表明，光谱剖面的偏最小二乘判别分析可以区分附着细菌生物量和未接种细菌生物量的表面；在该模型中，前两个主成分对方差的贡献率分别为39%和19%，估计错误率在4 个主成分之后趋于稳定，该评估的交叉验证准确率为100%。

目前，NIRs 的主要研究目标多为提高食源性致病菌分类模型的识别率，研究人员会比较线性分析法和非线性分析法、有监督的机器学习算法和无监督的机器学习算法等的使用效果，甚至比较各种复合使用效果，选择适用于不同数据集合的最佳化学计量学方法。Feng 等[13]同时使用线性（偏最小二乘判别分析）和非线性（最小二乘支持向量机技术）方法，建立一种新的基于近红外的菌种和菌株分类变量选择方法，并建立全波长和简化的校准模型来区分大肠杆菌和无核李斯特菌。试验结果表明，复合使用偏最小二乘判别分析和最小二乘支持向量机技术使正确分类率和模型简单性都比单独使用偏最小二乘判别分析法的结果有所提高；利用1 884、1 886、1 890 nm 3 个波长对大肠杆菌和无核李斯特菌进行种水平分类，分类正确率为100%。Chen 等[14]报道了一种无标记近红外表面增强拉曼散射检测饮用水中致病菌的方法，利用细菌细胞悬浮液中银纳米颗粒的原位合成，可鉴别出饮用水中大肠埃希菌、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和李斯特菌等几种常见病原菌，且SERS 谱的比较可以鉴别区分单核细胞增生李斯特菌和诺氏李斯特菌，该法是一种快速、选择性、无标记鉴定病原菌的方法。

利用NIRs 结合有效化学计量学方法，从光谱预处理、建立识别模型的角度针对食源性致病菌的分类识别鉴定已有较多研究，采用的线性方法包括偏最小二乘法PLS、线性判别分析LDA；非线性方法有二次判别分析QDA、相似性分析SIMCA 等，均具有较高的分类识别率，但大部分研究止于微生物的种水平，并未涉及亚种水平。虽然涉及细菌亚种水平识别检测的相关研究较少，但有限的研究显示，使用NIRs 对食源性致病菌进行种水平的分类识别率仍较高且具有准确性。

2 高光谱成像技术

2.1 高光谱成像技术检测常见食源性致病菌的原理

高光谱成像技术（hyperspectral imaging，HSI）是一个宽泛的术语，包括通过各种方式（如拉曼散射、傅里叶变换红外显微镜、荧光和近红外化学成像）获得的空间分辨光谱数据，是一种将成像或计算机视觉和光谱技术集成在一个系统中的复合技术，有透射和反射2 种工作模式，其中前者常用于较薄的样品以获取清晰、准确的图像；较厚样品则可用后者测量其反射率用以判断其生物特性[15-16]，HSI 是一种快速且非侵入性的技术。高光谱成像系统主要由光源、高光谱相机、载波台和计算机软硬件组成，当光源照射到待测物体的表面时，由于不同物质的组成、官能团有所不同，导致不同待测物质对特定波长有着不同的吸收度、分散度和反射率，2 个样品的光谱图像相似则表明，它们的化学成分和物理性质相似[17-18]，因此，通过分析光谱信号之间的差异可以对待测物进行定性、定量分析。与常规成像或光谱技术相比，HSI 可以同时测量图像中每个像素的空间信息和光谱参数。HSI 表示为超立方体I（x，y，λ），是包含1 个波长λ 和2 个空间（x，y）维的三维（3D）数据块。它既可以被认为是每个单独像素（x，y）处的光谱I（λ），也可以被认为是每个单独波长λ 处的图像I（x，y）。样本中的每个位置都会显示该像素的独特光谱指纹，该指纹可用来表征其化学成分[17-20]。因此，HSI 可用于同时识别和量化化学成分以及可视化其分布[21]，已广泛用于食品质量和食品安全的属性评价。

2.2 高光谱成像技术无损检测常见食源性致病菌的应用

HSI 提供了一种无需试剂的病原体识别技术，为在各种情况下检测微生物种类提供了一种低成本的方法。Seo 等[22]利用细菌细胞的形态特征，采用决策树和支持向量机（support vector machine，SVM）等多元分析方法对食源性致病菌进行分类。在基于细胞图像形态特征的食源性细菌分类中，DT 算法比SVM 算法表现得更好，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的分类正确率为89.7%，SVM 算法的分类正确率为82.9%；但DT算法对5 种细菌（金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和阴沟肠杆菌）的分类正确率下降到80.0%，而SVM 算法的分类正确率仅为72.5%。有研究分别用工作在近红外（10 470～5 880 cm-1）区域的宏观高光谱扫描仪、工作在近红外（12 500～5 800 cm-1）区域的带透射臂的FT-NIR 分光光度计和工作在4 000～675 cm-1区域的FT-MIR 显微镜不同设备进行研究，探究光谱和高光谱技术在凝胶培养基上检测细菌表面污染能力，并用于检测样品火腿切片上可导致火腿切片污染变化的弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）和樱花乳杆菌（Lactobacillus sakura）[23]。

HSI 结合光谱和图像技术，弥补了只有光谱信息或者只有图像信息造成的不全面问题。Kammies 等[24]研究了近红外高光谱成像和多元数据分析作为一种快速、无损的检测和鉴别细菌的工具的潜力。研究人员采集蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）在37 ℃条件下培养20 h 的近红外高光谱图像，以标准正态变量校正和Savitzky-Golay技术应用于1 103～2 471 nm 的波长。结果显示，对蜡样芽孢杆菌和葡萄球菌的预测效果最好，预测结果的正确率在82.0%到99.96%之间。目前，近红外高光谱成像技术已用于直接快速检测生鸡胸肉片中的假单胞菌，其中SNV-PLS 模型的校正、交叉验证和预测的相关系数和均方根误差分别为0.88 和0.60 lgCFU/g、0.83和0.71 lgCFU/g、0.81 和0.80 lgCFU/g[25]，高光谱成像技术被证明是无损检测生鸡胸肉片中假单胞菌的有效工具。

食品加工设备表面形成的生物膜，可为细菌培养提供环境，从而导致食物中毒，且一般毒性较强，因此，初步检测对食品卫生管理十分重要。Lee 等[26]利用荧光高光谱成像技术检测食品加工设施表面大肠杆菌（E.coli）和鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）的可行性。试验采用365 nm 紫外光光源发射紫外光，获得420～730 nm 范围内的荧光高光谱图像，图像用于进行判别分析（线性判别分析、K 近邻分析和偏最小二乘判别分析）以识别和分类在加工设备上生长繁殖的食源性病原菌生物膜。结果表明，大多数机器学习模型对大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的特异性和敏感性的判别性能均在90%以上，其中K-近邻模型的判别性能最好。该试验验证了生物膜检测的有效性，表明了利用荧光高光谱图像快速检测生物膜的可能性。

HSI 技术结合光谱学和计算机视觉的优点，被认为是实现检测自动化的传统方法的替代技术，能最大限度地减少食品安全问题发生。在高光谱成像中可以采取多种选择进行检测工作，包括近红外HSI、荧光HSI 以及拉曼HSI 等，这些选项使搜索各种检测问题的解决方案具有极大的灵活性，然而，HSI 中蕴含的丰富信息给数据处理带来困难，使其难以在工业在线应用。但不可否认的是，HSI 的多功能性为其在食源性病原菌检测中的广泛应用奠定了基础。

3 电子感官系统

3.1 电子感官系统检测常见食源性致病菌的原理

近年来，电子鼻、电子舌和电子眼等设备被开发出来，用于对真实基质进行原位研究，几乎不需要或根本不需要对样品进行操作。电子鼻（electronic noses，ENs）作为一种适合于检测挥发性化合物的非侵入性技术，已被应用于食品安全和质量分析。ENs 是一种通过结合具有部分特异性的化学传感器阵列系统和合适的模式识别系统来识别简单或复杂气味的设备。ENs 技术的基本原理是模拟动物的嗅觉，通过气体传感器阵列来检测和识别微生物产生的复杂的挥发性气体，再通过信号转化器传输给计算机进行数据处理分析，传感器对样品中的不同气体成分会产生不同的响应信号，以此来实现对不同的化学品和细菌进行鉴定和分类[27-29]。ENs 的核心部分包括：样品处理系统、气体传感器阵列与模式分析和识别（pattern analysis and recognition，PARC）系统。电子舌（electronic tongues，ETs）技术是一种模拟人味觉感知系统的传感器技术，基于化学传感器阵列和模式识别的液体分析多传感系统，与ENs 类似，其原理是将来自非特定传感器的信号与模式识别系统相结合，能够对待测样品中的各种滋味物质产生信号，从而检测分析样品品质[30]。ETs 技术检测食品中的微生物主要是通过测定微生物所引起的滋味物质的变化，与微生物污染状况建立相关性，从而对微生物的种类和污染程度进行鉴别区分[31]。电子感官的设计已经提出不同的传感器阵列，如电位传感器、伏安传感器、安培传感器、阻抗传感器、电导传感器、光学传感器、质量敏感传感器和基于酶的传感器[32]。

3.2 电子感官系统在无损检测常见食源性致病菌的应用

电子感官系统正在成为分析多种生物样本的一个优良选择，Green[33]使用ENs 系统来检测营养肉汤中的大肠杆菌和李斯特菌，并在不同肉汤浓度下区分细菌类型，结果表明，群体之间的分离是可实现的。基于有机-无机染料和碳纳米管的纳米复合气体传感器可用于食品中检测细菌和微生物气味，保证食品质量控制。为研究化学传感器在食源性致病菌快速检测中的应用，陈丽萍等[34]使用基于金属氧化物传感元件阵列的PEN3 型电子鼻传感器，根据其对不同食源性致病菌产生代谢产物的差异响应，研究该系统对食源性致病菌的快速区分效果。结果表明，在较低的细菌浓度下，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、粪链球菌、单核细胞增生李斯特菌这4 种常见食源性致病菌仍有较高的区分度。Seesaard 等[35]研制了一种由3 种有机-无机纳米复合气体传感器[四叔丁基酞菁锌、四苯基卟啉锌和四苯基卟啉钴] 与3 种商用金属氧化物半导体气体传感器组成的混合电子鼻，用于识别细菌挥发性化合物。结果表明，混合电子鼻确实能够区分细菌种类和培养基，在6 h 的培养时间内，PC1 的贡献率为92.4%，PC2的贡献率为7.2%。此外，系统聚类分析结果表明，细菌气味数据形成了两大类群，最大聚类距离接近25。革兰氏阴性菌中的两个菌种（阴沟肠杆菌和铜绿假单胞菌）的相似性较大，聚类距离接近4。而阴沟肠杆菌与伤寒沙门氏菌的最小距离约为1，与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的距离相等。

目前，常规方法只能用于在发生食物中毒现象后高精度地检测微生物，因此，预检简单的预检方法对食品安全保证具有重大意义。Gobbi 等[36]利用基于4 个金属氧化物传感器阵列的电子鼻EOS507C 分析了584 个样品的大数据集，在接种霍尔马氏杆菌和大肠杆菌分别在21 h 和18 h 后被诊断为污染，污染样品的LDA 分类性能达到98%。有研究旨在探讨快速ENs 系统在食源性细菌检测中的应用，该系统被应用于牛肉和香肠样品中的微生物检测，除对样品中的活菌数进行测定，还将ENs 应用于牛肉受不同细菌（大肠杆菌O157∶H7、伤寒沙门氏菌857、金黄色葡萄球菌29213和铜绿假单胞菌27853）感染前后的检测[37]。结果表明，该系统能定量测定50 ppb 到＞350 ppb 浓度范围内产生的挥发性有机化合物，各病原菌单独污染前后的气体浓度呈高度显著相关（p＜0.005）。以上研究显示，ENs检测系统可满足理想的工业筛查系统所有主要要求，即特异性、灵敏性、预诊性、重复性，且操作简单和经济实惠。通常，ENs 应用于气体样品中检测病原微生物，但Fujioka 等[38]利用电子鼻（FF-2A）快速检测培养上清液中的食源性致病菌嗜水气单胞菌培养30 min 后产生的挥发性模式的变化，结果表明，在起始浓度为9.6×102CFU/mL 的嗜水气单胞菌可在2 h 内被检测到，这也是首次利用ENs 根据嗜水气单胞菌产生的挥发性模式变化进行检测的报告。

超声波已在细菌灭活中被广泛应用，然而，传统的微生物检测超声处理肉制品效果的方法具有侵入性、劳动强度大、耗时长等缺点，因此，可利用ENs 系统和HSI 技术结合对处理10、20、30 min 的接种猪肉样品中的鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌的超声灭活效率进行无损检测[39]。采用无损检测技术联用的方式作为与最新食品加工技术互补的检测系统，能快速、无损地测量食品加工技术的应用效果。

电子感官系统如ENs、ETs 和EEs，在食品工业中作为食品安全评估的分析工具的相关研究越来越多。在ENs 和ETs 中，重量传感器、光学传感器和电化学传感器可用于分析挥发性化合物或液体样品，其中电化学传感器是最常见的传感系统。电子感官系统可以提供样品中食源性致病菌的鉴定区分的相关信息，只需很少的样品准备甚至无需准备，即可非侵入性地快速获得信息，是一种理想的在线检测工具。目前，针对食源性致病菌的无损检测常用ENs，其他电子感官系统更广泛应用于食品加工过程成分检测和食品新鲜度鉴定，对于食品中微生物的测定，ETs 和EEs 等系统常用于导致食品腐败变质的菌落总数或真菌污染的检测。

4 展望

无损检测技术具有快速、灵敏性和无侵入性等特点，是一种理想的在线检测技术，对食源性病原菌的检测应用具有巨大潜力，可对食品中的微生物进行定量检测、定性鉴别；在食品生产加工中对食品中微生物生长变化进行在线监测以及防止食品安全问题发生的预防监测等。目前，NIRs 技术适用于固体食品样品中微生物的测定，具有较高的区分识别率，缺点是未涉及亚种间分类且设备昂贵；HSI 适用于固体食品样品中微生物的测定，具有光谱信息结合图像信息更全面准确的优点，缺点是数据处理困难、设备昂贵、工厂应用困难；ENs 技术、ETs 技术分别适用于气体样品、液体样品，可作预检方法、食品加工过程成分检测、食品新鲜度鉴定、食品中微生物的测定，具备非侵入性和样品无需预处理的优点，缺点是应用种类单一。

在未来研究中，NIRs 着力于进一步探究多种食源性致病菌的同时检测以及采用更高效的光谱预处理方法提高模型精度以对食源性致病菌的亚种水平进行鉴定区分；HSI 技术则需要更好利用光谱信息与图像信息的融合，探究合适的数据处理方法以适用于食品工业工厂；更灵敏的传感器阵列方式的应用是进一步发展电子感官系统的重心。每种检测技术都有其合适的适用范围，在实际生产实践中，采用多法联用能更全面地检测食品样品中的食源性致病菌信息，是无损检测技术进一步发展的方向。目前，无损检测技术仪器除部分电子感官系统外仍为大型仪器，处于实验室水平，实际应用于食品工厂中检测食源性致病菌仍需对仪器进行小型化、智能化研究。