延后栽培对‘夏黑’葡萄果实品质的影响

周晴,夏龙腾,罗飞雄,杨国顺,徐丰,许延帅*

(1.湖南农业大学园艺学院/湖南省葡萄工程技术研究中心,湖南 长沙 410128;2.永州市柑桔科学研究所,湖南 永州 425045)

葡萄一年两收栽培技术是指一年内生产两造(两茬、两季)葡萄的栽培模式,分为促早栽培和延后栽培［1］。其中延后栽培是指将正常物候期推迟,实现果实在晚秋或初冬上市的栽培模式。世界最早有关延后果的报道是苏联科学家利用葡萄冬芽生产延后果［2］。柳子明［2］利用春季修剪主梢促使‘小白玫瑰香’夏芽副梢上的冬芽萌发3次结果,为我国葡萄一年多次结果的研究奠定了基础。林守仁［3］利用‘紫玫瑰香’上的冬芽成功生产延后果。进入21世纪,我国台湾地区也进行了葡萄一年多次结果的技术研究,随后广西地区科研人员结合当地气候条件,并结合冬芽的花芽分化情况、破眠技术、一年两收栽培技术、植物生长调节剂的使用等方面进行了研究,形成了两代同堂和两代不同堂的新型栽培模式［1,4-6］。美国加州在酿酒葡萄上也应用了延后栽培技术［7］。有研究表明延后果的总糖、花青素、可溶性固形物和还原糖含量以及固酸比等优于一次果,而穗重、单粒重、果实纵横径等均低于一次果［4-6］。陈爱军等［8］认为剪梢促花时期过早不利于提高‘夏黑’延后果的还原糖和可溶性固形物含量。目前延后栽培技术已经在湖南、广东、福建、海南等南方地区有一定的应用［9］。

糖酸是葡萄果实最重要的内在品质指标,也是最直观的口感指标。糖不仅决定着葡萄果实的甜度和风味,而且影响着色、香气物质以及特殊风味物质的形成［10］。果实中糖组分包括蔗糖、葡萄糖、果糖、山梨醇、木糖、水苏糖、棉子糖等［11］。成熟的葡萄果实中含量最多的糖是果糖和葡萄糖,两者的比值接近于1,其次是蔗糖,这3种糖含量占成熟果实中可溶性糖含量的90%以上［12-13］。不同糖组分之间的甜度不同,当蔗糖甜度为1时,果糖甜度是蔗糖的1.73倍,葡萄糖仅为蔗糖的0.74倍［14］。成熟的葡萄果实中有机酸含量很低,主要以酒石酸、苹果酸、柠檬酸为主,酒石酸酸味较涩,柠檬酸酸味清爽,苹果酸酸味苦涩且酸度维持时间长,3种酸的酸味强度排序为苹果酸、酒石酸、柠檬酸。在成熟的葡萄果实中,酒石酸和苹果酸占果实总酸的90%以上,2种酸在不同葡萄品种之间存在一定差异［15-17］。

葡萄果实中蔗糖代谢相关的酶主要是蔗糖合成酶(sucrose synthase,SS)、蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase,SPS)和转化酶(invertase,INV)。SS具有蔗糖合成活性(SSⅡ)和蔗糖分解活性(SSⅠ),既能合成蔗糖也能分解蔗糖。SPS是催化蔗糖合成的限速酶。INV催化蔗糖水解产生以果糖和葡萄糖为主的己糖(此反应为不可逆反应),根据细胞环境pH值的不同,INV又可以分为酸性转化酶(acid invertase,AI)和中性转化酶(neutral invertase,NI)。根据蔗糖合成来源与分解去向,上述酶可分为蔗糖合成方向酶(SSⅡ+SPS)和蔗糖分解方向酶(SSⅠ+NI+AI)［11,18-19］。

目前,延后栽培的研究主要集中在栽培技术和果实品质等方面,而果实发育过程中糖酸变化规律相关的研究报道较少。本试验通过比较正常栽培和延后栽培2种不同的栽培模式,研究‘夏黑’葡萄果实发育过程中果糖含量、葡萄糖含量、蔗糖含量、果糖与苹果酸的比值以及蔗糖代谢相关酶活性的变化规律,旨在为‘夏黑’葡萄错峰上市的延后果实的品质提升提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试品种为9年生的‘夏黑’葡萄, 2012年定植于湖南农业大学干杉科研基地(113°11′54″E, 28°8′21″N)。栽培模式:南北走向,起垄栽培(垄高0.5 m,垄宽2.0 m),树形为独龙干形,叶幕为“飞鸟”形,树干高度60 cm,株行距为2.8 m×1.8 m,钢架型简易小棚架避雨栽培,地面铺设两条滴灌带。

1.2 试验方法

1.2.1 试验树处理与采样试验分2种处理:正常栽培(对照)和延后栽培(延后果)。选定的树体中庸、健康且一致,按照随机区组设计,每个处理各选相邻3株为1个重复,各设3次重复,共计18株。

正常栽培技术(肥水管理、整形修剪、花果管理等)参照王华新等［20］方法并根据本地气候情况稍做调整。水分管理:萌芽期以前需要控制水分用量,开花期开始后逐渐增加水分用量,果实膨大期水分用量达到最高,吸收根附近土壤水分含量达到75%以上,成熟期适当控制水分,使吸收根附近土壤水分含量达到40%～50%。主要施肥情况:2种栽培模式施用基肥的时间均为2020年11月10日,施肥用量为有机肥30 000 kg·hm-2,菜枯为15 000 kg·hm-2,施肥方式为单侧沟施。正常栽培与延后栽培的萌芽肥为国光-松尔肥(25-5-15)复合肥,萌芽肥的施用时间分别为2021年3月13日和2021年5月4日;膨果肥的施肥时间分别为2021年5月21日和2021年7月18日,肥料为满是得大量元素水溶肥800倍、国光络佳钙1 000倍、国光磷酸二氢钾2 000倍、拓戈新有机水溶肥800倍、根莱士含腐植酸水溶肥1 000倍,上述5种肥料混合使用;着色肥的施用时间分别为2021年6月21日和2021年8月1日,肥料为满是得大量元素水溶肥800倍、根莱士含腐植酸水溶肥1 000倍、拓戈新有机水溶肥800倍、国光壮多微量元素水溶性肥1 500倍,上述4种肥料混合使用。

延后栽培技术参照白先进等［21］方法并稍做修改:2021年4月15日(花前3周)去除正常果实花序;当年生枝条长放,不做任何修剪处理。2021年4月30日,在主梢第6节位进行短截,除顶端夏芽副梢保留外,其他副梢全部修剪干净。待冬芽发育饱满后(10 d后),去除顶端夏芽副梢,解除其对顶端冬芽的抑制,促使其萌芽并开花结果,后期栽培管理与正常栽培一致。

1.2.2 试验样品采集2个熟期的浆果分别从花后30 d起开始采样,之后每隔7 d采样1次直至果实成熟,分别为30、37、44、51、58、65、72和79 d。正常栽培对应的采样时期分别为:6月7日、6月14日、6月21日、6月28日、7月5日、7月12日、7月19日、7月26日。延后栽培对应的采样时期分别为:7月19日、7月26日、8月2日、8月9日、8月16日、8月23日、8月30日、9月6日。每次采样随机抽取果穗,每串分上、中、下3个部位各取2粒浆果,共计采样500 g浆果。一部分样品用冰盒包裹后带回实验室,用于浆果体积、可溶性固形物含量、单粒重、蔗糖含量、葡萄糖含量、果糖含量的测定;另外一部分样品液氮速冻后带回实验室,存放于-80 ℃冰箱,用于酶活性的测定。

1.2.3 体积的测定将葡萄果粒充分混合,从中随机挑选9粒并用数显卡尺测定。浆果体积近似椭圆形,体积公式［22］为:V=4/3×π×(H/2)×(R/2)2。式中:V为葡萄浆果体积(cm3);H为葡萄浆果纵径(cm);R为葡萄浆果横径(cm)。

1.2.4 可溶性固形物含量的测定将葡萄果粒充分混合,从中随机挑选9粒磨浆后用PAL-1糖度计测定,可溶性固形物含量重复3次。

1.2.5 单粒重的测定将葡萄果粒充分混合,从中随机挑选10粒,用电子天平称量总重后计算单粒重,重复3次。

1.2.6 单糖的测定果糖、葡萄糖、蔗糖含量测定均采用高效液相色谱法,参照李佳秀等［23］的试验方法并稍做修改:将浆果充分混合,从中随机挑选100 g,用榨汁机充分榨汁,再用医用无菌纱布过滤得汁液,装入试管中备用。30 ℃下,将溶液超声20 min后取1.0 mL上清液于2 mL离心管内,10 000 r·min-1离心10 min;取上清液于0.22 μm微孔滤膜过滤,待上机检测。Agilent 1260高效液相系统为美国Agilent公司产品,色谱柱为Agilent,ZORBAX Original 70Å糖分析柱,4.6 mm×250 mm,5 μm;流动相70%乙腈,1.0 mL·min-1,柱温40 ℃;进样量10 μL;RID 检测器 1260 RID,40 ℃。样品稀释2倍后上机测定。

1.2.7 苹果酸、酒石酸和柠檬酸的测定苹果酸、酒石酸和柠檬酸含量参照方海猛等［24］的方法测定,并计算果糖与苹果酸的比值。

1.2.8 相关酶活性测定蔗糖代谢相关酶(AI、NI、SSⅠ、SPS、SSⅡ)活性均采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA),试剂盒由诺敏科达(武汉)生物科技有限公司提供。

试验步骤:1)随机挑选3粒葡萄果实,在液氮里充分研磨,装试管于-80 ℃冰箱中保存备用。2)称取0.1 g样品于研钵中,加入1 mL提取液(5种酶用5种相应酶的提取液),冰浴匀浆后转入离心管中。4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min,取上清液。3)后续操作按照各试剂盒说明书进行,使用紫外可见分光光度计(UVmlml-1280,岛津仪器有限公司)在450 nm波长下检测吸光度(D值)。

1.3 数据处理

试验采用完全随机设计,所得试验数据采用SPSS v20.0软件分析其显著性差异;用Microsoft Excel 2010软件进行数据分析和处理。

2 结果与分析

2.1 延后栽培对‘夏黑’葡萄果实外观的影响

由图1可见:正常和延后果果实均在花后44 d开始转色,转色期后,正常果实着色较延后果果实深。花后30～70 d,延后果果实大小明显较小。

图1 对照和延后果果实外观的变化趋势Fig.1 Change trend of fruit appearance in control and delayed fruits

2.2 延后栽培对‘夏黑’葡萄果实单粒重和果实体积的影响

由图2-A可见:对照和延后果果实的单粒重在花后30～58 d呈上升趋势,花后58 d以后趋于平缓,但各采样时期的单粒重均为对照果实大于延后果,且差异显著,最终分别为8.20、3.64 g。

图2 对照和延后果果实单粒重(A)和果实体积(B)的变化趋势Fig.2 Change trend of single grain weight(A)and fruit volume(B)in control and delayed fruits不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Different small letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as follows.

由图2-B可见:对照和延后果果实的体积在花后30～58 d呈上升趋势,花后58 d以后趋于平缓。对照果实体积的增长符合双“S”曲线模型,而延后果的体积增长呈线性模式。各采样时期的果实体积始终是对照大于延后果,且差异显著,最终分别为30.27、11.33 cm3。

2.3 延后栽培对‘夏黑’葡萄果实可溶性固形物含量的影响

由图3可见:对照和延后果果实的可溶性固形物含量总体呈增长趋势。对照果实可溶性固形物含量随着果实生长发育而逐渐增加,而延后果可溶性固形物含量在花后65 d以前逐渐升高,之后基本停滞。在花后 58 d以前,延后果的可溶性固形物含量始终高于对照果实,花后58 d以后,两者含量相反,最终可溶性固形物含量为对照(17.6%)高于延后果(15.1%)。除花后79 d两者有显著性差异外,其余各采样时期两者的可溶性固形物含量均差异不显著。

图3 对照和延后果可溶性固形物含量的变化趋势Fig.3 Change trend of the soluble solids content in control and delayed fruits

2.4 延后栽培对‘夏黑’葡萄果实果糖、葡萄糖和蔗糖含量的影响

由图4-A可见:对照和延后果果实的果糖含量在整个果实发育期呈上升趋势。在花后44 d以前增加缓慢;花后44～65 d增加迅速,花后65 d与花后44 d相比,对照增加了160.32%,延后果增加了345.86%;花后72 d以后略有下降,随后上升,最终果糖含量对照为62.22 mg·mL-1,延后果为59.13 mg·mL-1。对照和延后果各采样时期的果糖含量均无显著性差异。

图4 对照和延后果果糖(A)、葡萄糖(B)和蔗糖(C)含量的变化趋势Fig.4 The change trend of fructose(A),glucose(B)and sucrose(C)content in control and delayed fruits

由图4-B可见:对照和延后果果实的葡萄糖含量的变化趋势与果糖含量的变化趋势相似,在花后44 d以前增加缓慢;花后44～65 d增加迅速,花后65 d与花后44 d相比,对照果实增加了127.35%,延后果增加了276.02%;花后72 d以后略有下降,随后上升,最终葡萄糖含量对照果实为56.02 mg·mL-1,延后果为48.15 mg·mL-1。对照和延后果各采样时期的葡萄糖含量均无显著性差异。

由图4-C可见:对照和延后果果实的蔗糖含量在整个果实发育期呈缓慢上升趋势,变化相对平稳且含量极低。延后果的蔗糖含量在花后44 d急剧上升达到1.05 mg·mL-1,在花后51 d含量下降至0.62 mg·mL-1。果实成熟时,对照果实蔗糖含量为0.97 mg·mL-1,延后果为0.86 mg·mL-1。除花后44 d外,对照和延后果其余各采样时期的蔗糖含量无显著性差异。

2.5 延后栽培对‘夏黑’葡萄果实中各糖酸组分比例的影响

由图5可见:在葡萄果实成熟时,延后果与对照果实的3种糖所占比例由高到低依次为果糖、葡萄糖、蔗糖,果糖与葡萄糖比值接近1,两者占糖含量的99%以上,而蔗糖含量不足1%。延后果中果糖所占比例高于对照,葡萄糖和蔗糖所占比例则是对照高于延后果。对照果实3种酸所占比例由高到低依次为苹果酸、酒石酸、柠檬酸,延后果依次为酒石酸、苹果酸、柠檬酸。延后果与对照相比,酒石酸的比例含量大幅度上升,柠檬酸和苹果酸的比例含量则下降,但苹果酸下降幅度更大,从42.17%下降至21.90%。

图5 对照和延后果成熟果实中糖组分(A)和酸组分(B)比例Fig.5 The percentage of sugar components(A)and acid components(B)in control and delayed ripening fruits

2.6 延后栽培对‘夏黑’葡萄果实果糖与苹果酸比值的影响

由图6可见:对照和延后果的果糖与苹果酸的比值随着果实的发育不断升高,在花后44 d以前增长速度趋于平缓,之后增长速度加快。从花后65 d以后,延后果比值一直高于对照果实;成熟时,延后果与对照果糖/苹果酸比值分别为63.06、45.61。花后65和79 d,延后果与对照差异显著,其余时期均无显著性差异。

图6 对照和延后果果糖与苹果酸的比值变化趋势Fig.6 The change trend of fructose/malic acid ratio in control and delayed fruits

2.7 延后栽培对‘夏黑’葡萄果实蔗糖分解方向酶活性的影响

由图7-A可见:在果实发育过程中,对照和延后果果实中的酸性转化酶(AI)活性变化趋势基本相同,均呈先下降后上升再下降的趋势;在花后51 d时,两者活性都在最低值,对照果实为3 812.75 U·g-1·h-1,延后果为4 348.81 U·g-1·h-1;在花后65 d时,两者活性都达到最高峰,对照果实为6 564.48 U·g-1·h-1,延后果为6 416.42 U·g-1·h-1。

图7 对照和延后果酸性转化酶(A)、中性转化酶(B)和蔗糖合成酶Ⅰ(C)活性的变化趋势Fig.7 Change trends of acid invertase(A),neutral invertase(B)and sucrose synthaseⅠ(C) activities in the control and delayed fruits

由图7-B可见:在果实发育过程中,对照和延后果果实中的中性转化酶(NI)活性总体趋势呈上下波动式变化;对照果实NI活性最高和最低分别出现在花后72 和37 d,分别为3 589.53、4 751.26 U·g-1·h-1。延后果NI活性花后30～44 d呈下降趋势,花后44～65 d呈上升趋势并达到最高值,在花后72 d急剧下降之后再上升。

由图7-C可见:对照果实中的蔗糖合成酶Ⅰ(SSⅠ)活性先下降后上升最后趋于平缓,在花后44 d活性最低(459.91 U·g-1·h-1),花后72 d时活性最高(775.44 U·g-1·h-1)。延后果果实中的SSⅠ活性总体呈先下降再上升随后下降的变化趋势,活性最大值出现在花后44 d(729.32 U·g-1·h-1),活性最小值出现在花后65 d(418.77 U·g-1·h-1)。在花后51 d以前,延后果的SSⅠ活性始终高于对照果实,在花后51 d以后两者活性相反。

2.8 延后栽培对‘夏黑’葡萄果实蔗糖合成方向酶活性的影响

由图8-A可见:对照和延后果蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性总体趋势呈上下式波动变化。对照果实SPS活性先下降后上升再缓慢下降,在花后37 d时活性最低,在花后44 d时活性最高。延后果的SPS活性在花后58 d前呈波动式上升,随后下降并趋于平缓,在花后58 d时活性最高,在花后65 d时活性最低。

图8 对照和延后果蔗糖磷酸合成酶(A)和蔗糖合成酶Ⅱ(B)活性的变化趋势Fig.8 The change trend of sucrose phosphate synthase(A)and sucrose synthaseⅡ(B) activities in the control and delayed fruits

由图8-B可见:对照果实蔗糖合成酶Ⅱ(SSⅡ)活性总体呈波动变化;活性最高及活性最低分别出现在花后37和65 d,分别为857.80、521.60 U·g-1·h-1。延后果的SSⅡ活性呈上升、下降、上升再下降的动态趋势,活性最高及活性最低分别出现在花后5和65 d,分别为835.49和595.08 U·g-1·h-1。

3 讨论与结论

葡萄的还原性总糖包括果糖、葡萄糖和蔗糖［25］,有机酸主要包括苹果酸、柠檬酸、酒石酸［15-17］。本研究中,从花后30 d至果实成熟,延后果果实中果糖、葡萄糖和蔗糖的含量在绝大部时期低于对照。温度对光合作用及还原性糖的积累有重要的影响,因为光合效率较高的最适温度通常在20～30 ℃,当温度高于35 ℃时,气孔关闭导致光合作用急剧下降,光合效率低下［26］,从而影响了糖分的积累。另外陈爱军等［8］在‘夏黑’二次果的研究中表明,对主梢短截时间过早,不利于糖分(可溶性固形物)的积累。因此,本研究中延后果生长季处于七八月份,对照生长季处于六七月份,可能是修剪时间过早,延后果在湖南的生长温度均高于对照,不利于还原性糖(可溶性固形物)在延后栽培果实中的积累。自转色期开始至果实成熟,果实里有机酸含量逐渐降低,高温条件下更有利于酸的降解,当温度高于38 ℃时,苹果酸的含量急剧下降［23,27-28］。

果实内的可溶性糖和有机酸含量及其比例共同决定果实甜酸风味［29］。其中,在葡萄果实中果糖是最甜的糖,苹果酸是酸度最强的酸,因此,果糖与苹果酸的比值在一定程度上能反映果实的糖酸风味。本实验室前期研究表明,延后果在糖酸口感风味上整体好于对照果［4,30］,本研究中,葡萄成熟时,延后果的果糖比例略高于对照,而苹果酸比例远远低于对照。在花后65 d之后,延后果的果糖与苹果酸比值均高于对照果实,成熟时延后果的果糖与苹果酸比值比对照果实高38.30%,推测这是延后果果实糖酸风味在一定程度上要比对照果实好的重要原因之一。

葡萄着色受花青素的调控并与果实中糖含量极显著正相关［31-32］,高温(>33 ℃)则抑制花青素的积累［33］。本研究中,延后果果皮从肉眼上看比对照果实着色差,延后果的着色期正值8月,在湖南省属于高温天气,同时延后果的还原性糖含量均小于对照,即延后果的高温和低糖环境,可能是导致延后果的着色能力比对照差的原因之一。延后果的单粒重和体积均差于对照且差异显著,这与熊榆等［4］的研究结果一致。高温不利于果实细胞分裂,导致细胞数量偏少［34］。本研究中,延后果生长季的温度均高于对照,推测延后果中的果肉细胞数量少于对照,从而导致延后果的单粒重和体积明显小于对照。延后栽培果实的生长由双“S”变为线性关系,其原因可能是在花后58 d以前延后果果实生长季处在高温环境,细胞分裂程度不够,导致果肉细胞整体数量偏少,细胞的膨大和增长量不明显,从而呈线性关系。但延后果实大小与果皮着色方面的研究还需进一步提升。

蔗糖合成酶类(SPS+SSⅡ)促进蔗糖的积累,蔗糖分解酶类(AI+NI+SSⅠ)促进己糖的积累［18］。本研究中,‘夏黑’葡萄果实中2个熟期的蔗糖分解酶类活性远高于蔗糖合成酶类活性,从而导致果实葡萄糖与果糖含量远高于蔗糖,这与李梦鸽等［13］研究结果一致。INV主要促进己糖的积累［19］,本研究中2个熟期的AI和NI活性一直保持相对较高水平,可能与葡萄果实中的糖主要以己糖的形式存在有关。SSⅠ与SSⅡ在葡萄果实整个发育期变化较平缓［13,35］。本研究中,SSⅠ与SSⅡ活性偏低并且变化趋势相对平缓,2个熟期间酶活性均无显著性。在花后51 d以前,对照的SSⅠ活性高于延后果,之后二者趋势相反,推测延后栽培能促进果实发育前期SSⅠ活性,抑制中后期SSⅠ活性。本研究中各时期的蔗糖含量极低,而SPS是合成蔗糖的限速酶［11］,推测是蔗糖合成受到抑制。对照和延后果各采样时期的各酶活均无显著性差异,相对应的糖在各采样时期也无显著性差异,说明这几种蔗糖代谢相关酶可能同时对果实糖积累产生影响。

综上所述,与正常栽培相比,延后栽培成熟果实中的果糖比例提高、成熟果实中苹果酸比例降低、果糖与苹果酸比值提高;延后栽培果实的果糖、葡萄糖和蔗糖含量均未提高,果实体积变小、单粒重降低。花后30～51 d,延后栽培果实的蔗糖合成酶Ⅰ(SSⅠ)活性比正常栽培的高,花后51 d后该酶活性降低。2个栽培模式下,果实发育中的转化酶、蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶的酶活性均无显著性差异。另外,果糖/苹果酸比值的升高可能是延后果糖酸风味较好的原因之一。