miR-196通过靶向调控CDK6表达对骨肉瘤细胞增殖的影响

张靖勇,贺 明

(中国医科大学附属盛京医院 骨科,辽宁 沈阳110000)

骨肉瘤是一种转移率高、恶性程度高的原发性骨肿瘤,最常见于青少年和儿童[1]。近年来,随着新辅助化疗与保守手术切除的结合,骨肉瘤患者的5年存活率从以往的不足20%提高至60%以上[2]。但骨肉瘤患者的复发和转移这两大难题仍然难以解决,约有1/3的患者出现局部复发,其中转移患者复发率可高达1/4[3]。细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinases,CDKs)家族包含13种不同的丝氨酸/苏氨酸激酶,CDK6和与其高度同源的CDK4是较为经典的细胞周期激酶,它们通过与D型细胞周期蛋白(D1、D2和D3)结合,调节细胞周期进展和转录等多种关键细胞进程。这些激酶的异常激活会导致细胞周期紊乱,从而使细胞的增殖出现失控,进一步导致癌症的发展[4]。MicroRNAs(miRNAs)是一类高度保守的内源性非编码RNA,它可以识别靶信使RNA(mRNA)3’端非翻译区的特定种子序列并与之结合,通过降低mRNA自身结合的稳定性或干扰蛋白质的翻译对基因的表达产生影响[5]。在增殖、分化、凋亡和组织内环境稳定的背景下,miRNAs参与机体内多种生物学功能和细胞进程的调节,同时也参与癌症的形成和转移[6]。研究表明miR-196a-5p在卵巢癌和结直肠癌中过度表达,且其高表达的水平与这些癌的进展和转移有关[7-8]。还有研究证实了miR-196b通过靶向抑制FOXP2来促进肝癌的进展,miR-196b高表达的肝癌患者5年生存率和无病生存率显著降低[9]。本研究通过生物信息学分析miR-196在骨肉瘤中的差异性表达,实验验证miR-196在骨肉瘤中对CDK6的表达是否具有调控作用,从而明确miR-196对骨肉瘤细胞增殖的影响并初步研究其分子作用机制,为骨肉瘤的临床诊治和预后开辟新的领域。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验细胞 人骨肉瘤MG63细胞与U2OS细胞购于中国科学院上海生物科学院细胞源中心。

1.1.2试剂 DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司,miR-196 mimic、miR-196 inhibitor、miR-196 control、CDK6和内参U6 PCR引物的设计及双荧光载体的构建均购自广州锐博生物技术有限公司,Lipo-fectamine3000转染试剂、Trizol试剂、PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司,四氮唑蓝(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide,MTT)购自美国 Sigma-Aldrich公司,CDK6抗体和GAPDH 抗体购自英国 Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1miR-196在骨肉瘤中的表达分析 通过沈阳陌信信息技术有限公司对miRNA在骨肉瘤组织中的表达进行差异性分析,使用miRDB(www.mirdb.org)数据库寻找CDK6蛋白的mRNA序列,并寻找能够调控CDK6蛋白的潜在miRNA序列及靶点,对其相关性进行分析。

1.2.2细胞培养 配制骨肉瘤MG63和U2OS细胞培养基(高糖DMEM+10%FBS+1%青-链霉素双抗混合液);当细胞生长至融合度大约为80%以上时用胰酶消化传代,置于37℃、5%CO2的孵箱中培育。

1.2.3细胞转染 将处于对数生长期的骨肉瘤MG63和U2OS细胞取出,使用胰酶进行消化处理,均匀地接种于6孔板中,待细胞密度长至50%～70%时根据说明书分别将miR-196 mimic、miR-196 control和miR-196 inhibitor转染于骨肉瘤MG-63细胞中。

1.2.4实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测mRNA表达水平 收集转染48 h后的细胞,加入1 ml Trizol吹打裂解细胞后转入EP管中室温下静置,再加入0.2 ml氯仿,于手中用力震荡少许时间静置2～3 min后以12 000 g(2～8℃)的条件离心15 min。取上层水相加入到另一EP管中并加入0.5 ml异丙醇,再次按上述步骤震荡静置离心。弃去上清,加入1 ml 75%乙醇洗涤后再螺旋混合,再次离心弃上清获得细胞的总RNA,再通过反转录得到cDNA。PCR检测方法使用SYBR Green法,PCR扩增条件如下:先于94℃环境中预变性3 min,而后94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 2 min,一共进行35个循环。检测引物如表1。

表1 RT-qPCR检测引物序列

1.2.5MTT实验测定细胞活性 于转染6～8 h后使用胰酶消化细胞,以4×103个/孔的浓度接种于96孔板中,分别在培养至0 h、12 h、24 h、36 h、48 h进行MTT实验,每孔加入10 μLMTT溶液(5 mg/mL)培养4 h,弃去上层清液后再于每孔中加入100 μL DMSO,室温下低速震荡混匀10 min后测定OD490 nm吸光度(A)值。

1.2.6双荧光素酶报告基因实验验证miRNA与mRNA的调控关系 收集转染48 h的MG-63与U2OS细胞,消化稀释后以1×104个细胞/孔的浓度接种于24孔板中,继续培养24 h,当细胞融合度达到80% ～90%左右时,按照1.2.3进行转染,将构建好的CDK6的野生型(WT-CDK6)和突变型(MUT-CDK6,突变了二者的结合位点)双荧光素酶报告载体分别与miR-196 mimic和miR-196 control共转染培养好的MG-63细胞转染48 h,收集细胞验证转染效果,将转染的细胞使用裂解缓冲液于室温下裂解20 min,离心收集上清,加入荧光素酶底物后立即使用发光仪对荧光素酶活性进行检测。以海肾荧光素酶活性为内参,计算萤火虫荧光素酶活性。

1.2.7Western blotting检测蛋白表达 取出培养的细胞吸净培养液后加入细胞裂解液,于冰盒上充分裂解后再吸出裂解液。提取各组总蛋白进行蛋白定量,120 V恒压电泳60 min分离蛋白,电泳结束后切取条带,加入转膜缓冲液,恒定电流200 mA转膜2 h。室温下,将PVDF膜使用快速封闭液封闭1 h后将PVDF膜放入一抗中4℃水平摇床孵育过夜。吸去一抗后TBST洗膜3次,每次5～10 min。再加入按说明书比例稀释好的标记二抗室温孵育1 h并洗膜后,系统发光成像,检测目的蛋白的表达情况。

1.3 统计学处理

图表中的数据资料采用均数±标准差表示,miR-196和CDK6的相关性通过spearman相关系数进行分析,采用单因素或多因素方差分析对各组数据之间差异是否显著进行评估,P<0.05为差异具有统计学意义。所有实验数据均使用GraphPad 8.1进行数据统计和分析处理。

2 结果

2.1 miRDB数据库及生物信息公司分析miR-196在骨肉瘤中的表达情况并筛选可能靶向CDK6的miRNA序列

通过信息技术公司分析miR-196在骨肉瘤中的表达,结果显示miR-196在骨肉瘤中的表达显著下调1.773 993倍,差异具有统计学意义(P<0.05),见表2。通过miRDB数据库筛选发现miR-196前体序列与CDK6序列有结合位点,说明CDK6可能是miR-196的靶基因之一(图1)。

图1 miR-196与CDK6存在结合位点

表2 生信预测miR-196在骨肉瘤细胞中的表达情况

2.2 spearman相关系数分析骨肉瘤中miR-196和CDK6表达的相关性

对miR-196和CDK6在骨肉瘤组织中的表达量使用spearman相关系数进行相关性分析,统计分析结果指出miR-196与CDK6在骨肉瘤组织中的表达呈负相关(rs=-0.8055,P<0.05,图2),说明miR-196的过表达能够抑制CDK6在骨肉瘤中的表达。

图2 miR-196和CDK6表达的相关性分析

2.3 双荧光素酶报告基因实验验证miR-196与CDK6在骨肉瘤中的关系

通过miRDB生物数据库分析发现CDK6与miR-196存在结合位点,由此猜测CDK6可能是miR-196的靶基因之一,因此采用荧光素酶报告基因实验分别对骨肉瘤MG63细胞系和U2OS细胞系中miR-196与CDK6的靶向结合进行验证,见于图3A与图3B。CDK6-WT+miR-196 control组的荧光活性低于CDK6-WT+miR-196 mimic组,两者相比差异较为显著(P<0.05)。CDK6-MUT+miR-196 control组和CDK6-MUT+miR-196 mimic组的荧光活性相比差异无统计学意义(P>0.05)。

图3 荧光素酶报告基因实验验证miR-196与CDK6的相互作用(*)*P<0.05)

2.4 RT-qPCR检测骨肉瘤中miR-196对CDK6表达的调控

采用RT-qPCR分别验证MG63与U2OS细胞系中miR-196对CDK6表达的调控作用,结果显示,对比miR-196 control组,miR-196 mimic组中miR-196的表达显著上调,与此同时miR-196 mimic组中的CDK6表达量显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05),见图4A与图4C。对比miR-196 control组,miR-196 inhibitor组中miR-196的表达下调,而miR-196 inhibitor组中CDK6的表达显著上调,差异具有统计学意义(P<0.05),见图4B与图4D。

图4 RT-qPCR检测miR-196和CDK6的表达水平(*)*P<0.05)

2.5 Western blotting检测骨肉瘤中miR-196和CDK6表达的关系

采用western blotting分别检测MG63细胞和U2OS细胞中miR-196 control组、miR-196 mimic组和miR-196 inhibitor组中CDK6蛋白的表达情况,以GAPDH为内参。结果显示miR-196 mimic组中CDK6蛋白表达量减少,而miR-196 inhibitor组中CDK6蛋白表达量增多,差异有统计学意义(P<0.05),见图5A与图5B。

图5 western blotting检测CDK6的表达

2.6 miR-196过表达或低表达对骨肉瘤MG-63细胞增殖的影响

miR-196 mimic与miR-196 inhibitor转染后采用MTT实验检测骨肉瘤MG63和U2OS细胞的增殖能力,结果如图6所示。与转染miR-196 control组相比,转染miR-196 mimic组的增殖活性在12 h、24 h、36 h和48 h均显著降低(P<0.05,图6A与图6C),而转染miR-196 inhibitor组的增殖活性在12 h、24 h、36 h和48 h均有不同程度的升高(P<0.05,图6B与图6D)。实验证明过表达miR-196能够抑制骨肉瘤MG63和U2OS细胞的增殖活性,而当miR-196呈低表达时能够促进骨肉瘤MG63和U2OS细胞的增殖能力。

图6 miR-196 mimic和miR-196 inhibitor对骨肉瘤细胞增殖的影响(*)*P<0.05)

3 讨论

目前miRNA在骨肉瘤领域的研究取得了大量进展,为肿瘤的临床诊治、化疗耐药以及改善预后等提供了新的思路。HE等[10]发现miR-486可以靶向抑制PKC-δ信号通路而抑制骨肉瘤MG-63细胞的增殖和侵袭,可见miR-486是骨肉瘤潜在的治疗靶点之一。另外一些miRNA的靶点与骨肉瘤的病理生理学有关,SUN等[11]证明了FOS样抗原2(FOSL2)是miR-143-3p的直接靶点,并检测出miR-143-3p在预后不良的骨肉瘤患者中表达下调,当miR-143-3p过表达时能够抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭,促进骨肉瘤细胞的凋亡。而FOSL2在骨肉瘤中的过量表达能够逆转miR-143-3p的作用,从而得出结论,miR-143-3p通过靶向FOSL2抑制骨肉瘤的增殖、侵袭和转移。这些研究共同支持miRNAs在骨肉瘤方面可能具有诊断和治疗价值的观点。

近年来miR-196已被许多研究证实其参与肿瘤的发生和进展,ZHAO等[12]和KANNO等[14]发现,miR-196b通过靶向抑制SOCS2的表达来促进喉鳞状细胞癌的增殖和侵袭能力,并抑制其癌细胞的凋亡,从而可将miR-196b视为喉鳞状细胞癌的一个预后因素。LI等[13]发现miR-196b在非小细胞肺癌中过表达,且与其靶基因GATA6的表达呈负相关,并证明miR-196b的过表达通过靶向GATA6而促进非小细胞肺癌的侵袭和转移。同时,在胰腺癌中,KANNO等[14]发现miR-196b的高表达与胰腺癌患者的不良预后显著相关,miR-196b可以作为胰腺癌患者的生物标志物来检测和评估患者的预后情况。还有一项研究指出miR-196a-5p可能参与了小鼠破骨细胞中对线粒体代谢的抑制作用,从而证实了miR-196-5p能够抑制小鼠体内破骨细胞的形成[15]。

CDK在促进癌症发生发展方面的关键性使其成为受到大量关注的潜在药物靶点。CDK4/6抑制剂能够使细胞周期中G1期到S期的进展出现阻滞进而抑制肿瘤细胞的增殖[16]。除了阻断细胞周期外,CDK4/6抑制剂还能通过多种作用机制来抑制肿瘤细胞的生长,如增强信号通路抑制剂引起的细胞抑制、诱导衰老、调节细胞代谢,甚至促进抗肿瘤免疫反应等[17]。ZHU等[18]发现miR-29b通过抑制CDK6蛋白的表达而起到了抑制骨肉瘤细胞增殖和迁移的作用,揭示了靶向CDK6是miRNAs作用于骨肉瘤的一种新的调节途径。TIAN等[19]也证实了miR-497通过靶向CDK6和plexinA4来抑制骨肉瘤的生长和迁移,首次阐明了miR-497和CDK6、plexinA4之间的关系及其在骨肉瘤中的作用。但目前关于miR-196能否通过靶向调控CDK6的表达来影响骨肉瘤细胞增殖的研究尚未见相关报道,本研究填补了这一空白。

本研究分析了骨肉瘤组织中miR-196的差异性表达情况,发现miR-196在骨肉瘤组织中的表达量显著下调,且通过MTT实验证明过表达的miR-196可以抑制骨肉瘤MG63和U2OS细胞的增殖,证实了miR-196在能够抑制骨肉瘤发生与进展的作用。此外,还通过生物信息学预测结果发现CDK6与miR-196的前体序列存在结合位点,猜测CDK6可能是miR-196的靶点并对其进行验证。使用spearman相关系数对miR-196和CDK6在骨肉瘤组织中的表达量进行相关性分析,结果显示二者呈负相关(rs=-0.805 5,P<0.05)。通过萤光素酶报告基因实验证明miR-196在骨肉瘤组织中能够显著抑制CDK6的活性,又采用RT-qPCR检测miR-196和CDK6在mRNA水平表达的调控关系,western blotting检测在miR-196调控下骨肉瘤MG63和U2OS细胞中CDK6蛋白的表达情况。结果显示过表达miR-196能够显著地抑制CDK6的表达,而miR-196的低表达则能够促进骨肉瘤中CDK6的表达。

综上所述,本研究发现miR-196在骨肉瘤中的表达显著下调,当miR-196过表达时,可以对骨肉瘤细胞的增殖起到抑制作用,并且能抑制CDK6的表达,由此推断得出miR-196通过靶向调控CDK6的表达而起到抑制骨肉瘤细胞增殖的作用。miR-196和CDK6有望成为新的骨肉瘤早期诊断和治疗的分子靶点,构建miRNA相关生物制剂可能从基因层面出发改变肿瘤细胞的转录翻译等过程,进而影响骨肉瘤的发生与进展,对骨肉瘤未来的临床护理和诊治情况做出改善。