LncRNA COL11A1-208在胃癌中的表达及对细胞增殖、侵袭和迁移的影响

陈 冲,徐 康,童 诚,崔建华,张祖芳

(东台市人民医院 消化内科,江苏 东台224200)

胃癌(gastric cancer,GC)是发病率较高的恶性肿瘤,是癌症相关死亡的主要原因之一[1]。尽管诊断技术和手术治疗方案不断进步、优化,但GC患者的预后并不理想,整体5年生存率仍较低下[2-3]。因此,识别GC的分子机制并研发新的治疗策略是必要的。

目前,基因治疗已成为癌症治疗领域的一个新的研究热点[4]。长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是一类长度不少于200个核苷酸的RNA,因缺乏开放阅读框而不具备编码蛋白功能,但LncRNA可通过选择性剪接、调控RNA转录和降解、表观遗传修饰等过程参与细胞分化、增殖、上皮-间充质转化、凋亡等多种生命活动,是细胞生物学的关键性调节因子[5-6]。近年来,研究证实LncRNA在包括GC在内的多种癌症患者的血清和癌组织中异常表达,与癌症的发生、进展紧密相关[7-9]。COL11A1-208为LncRNA家族新成员,先前研究表明其在口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)中高表达,可促进OSCC细胞增殖和侵袭,且与OSCC患者的不良预后相关,是OSCC有前景的诊断、预后生物标志物或治疗靶点[10-11]。然而,COL11A1-208在GC中的意义尚不清楚。本研究旨在通过观察COL11A1-208在GC中的表达及其表达改变对GC细胞增殖、侵袭和迁移的影响,分析COL11A1-208在GC发生和进展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2019年6月至2021年12月于东台市人民医院行手术切除的49例GC患者的癌组织及其癌旁组织(距癌组织≥3 cm)标本,所有组织标本均经液氮速冻后保存于-80℃。本研究获得医院伦理委员会批准,且患者在术前均签署知情同意书。

人正常胃黏膜上皮细胞(GES-1)及5种人胃癌细胞(AGS、MGC-803、MKN-45、BGC-823、SGC-7901)(货号ATCC-431、ATCC-209、H-MGC-803、ATCC-829、ATCC-274、ATCC-805)均购自上海康朗生物科技有限公司。

1.2 主要试剂

Gibcao澳洲FBS(货号10099141,上海吉至生化科技有限公司);100×青-链霉素双抗、1%结晶紫(货号P1400-100、G1062,北京索莱宝科技公司);Lipofectamine-2000、Trizol(货号11668027、YB-0102c,上海钰博生物科技公司);pcDNA3.1载体及pcDNA3.1-COL11A1-208、siRNA COL11A1-208(si-COL11A1-208)及其阴性对照(si-NC)由上海吉玛制药公司提供;CCK-8试剂盒(货号A311-01/02,南京诺唯赞生物科技公司);RIPA裂解液、BCA试剂盒、兔源一抗anti-GAPDH、山羊抗兔二抗(abs9231、abs9233、abs124037、abs20002)爱必信生物科技公司;兔源一抗anti-Ki67、anti-细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、anti-基质金属蛋白酶9(Matrix metalloproteinase 9,MMP9)和anti-神经型钙黏附蛋白(N-cadherin)(货号ab16667、ab16663、ab76003、ab245117,Abcam公司)。

1.3 细胞培养与转染

GES-1细胞、AGS细胞、MGC-803细胞、MKN-45细胞、BGC-823细胞、SGC-7901细胞均采用RPMI-1640培养基(含10%FBS、1%青-链霉素双抗),于37℃、5%CO2培养箱中培养,每24 h更换1次培养液,汇合度约90%时收集细胞。

将SGC-7901细胞以1×106个/孔接种至6孔板内,待细胞汇合度约80%时利用Lipofectamine-2000进行转染,将SGC-7901细胞分为Ctrl组(未进行转染)、pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1载体)、pcDNA3.1-COL11A1-208组(转染pcDNA3.1-COL11A1-208)、si-NC组(转染si-NC)、si-COL11A1-208组(转染si-COL11A1-208),继续培养48 h后,收集各组SGC-7901细胞,并通过qRT-PCR验证转染效果。

1.4 qRT-PCR检测COL11A1-208表达

1.5 CCK-8实验、克隆形成实验检测各组SGC-7901细胞增殖

CCK-8实验:将收集的1.3各组SGC-7901细胞接种至96孔板中(1×104个/孔),培养24 h后加入CCK-8溶液并继续培养2 h,借助SKSW-KC酶标仪测定450 nm波长处的吸光度(OD)。细胞增殖率(%)=(OD转染处理组-OD空白组)/(OD Ctrl组-OD空白组)×100%。

克隆形成实验:将收集的1.3各组SGC-7901细胞接种至6孔板中(1×103个/孔),培养24 h后置于4%多聚甲醛中固定20 min,而后置于1%结晶紫中染色10 min,于Olympus CKX31倒置显微镜下计数≥50个细胞的克隆数。

1.6 Transwell实验检测各组SGC-7901细胞侵袭

预先于Transwell小室底膜包被Matrigel,将收集的1.3各组SGC-7901细胞用不含FBS的培养基调成浓度为5×105个/mL的单细胞悬液,取200 μL接种至Transwell小室中,24孔板(下室)中加入600 μL含有10%FBS的培养基,培养24 h后取出Transwell小室,置于甲醛中固定30 min,用棉签轻轻拭去上层细胞,风干后置于1%结晶紫中染色10 min,借助Olympus CKX31倒置显微镜计数细胞数量,即为侵袭数量。

1.7 划痕愈合实验检测各组SGC-7901细胞迁移

将收集的1.3各组SGC-7901细胞接种至24孔板中(5×104个/孔),培养24 h后用100 μL枪头在孔中间竖着划1条直线,PBS清洗去除划下的细胞,继续培养24 h,而后于Olympus CKX31倒置显微镜下拍照,借助Image J软件计算细胞划痕面积愈合率。

1.8 Western Blot检测各组SGC-7901细胞增殖、侵袭和迁移相关蛋白

收集1.3各组SGC-7901细胞,加入RIPA裂解液提取总蛋白,BCA法测定浓度后进行定量、变性,随后进行凝胶电泳分离蛋白、转膜、封闭,孵育兔源一抗anti-GAPDH、anti-Ki67、anti-Cyclin D1、anti-MMP9和anti-N-cadherin(4℃过夜),次日室温孵育山羊抗兔二抗2 h,滴加ECL发光液后置于BJ75-JY04S-3C凝胶成像分析系统中拍照,借助Image J软件进行灰度分析。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 COL11A1-208在GC癌组织和细胞中的表达情况

与癌旁组织比较,GC癌组织中COL11A1-208表达增加(P<0.05);与GES-1细胞比较,AGS细胞、MGC-803细胞、MKN-45细胞、BGC-823细胞、SGC-7901细胞中COL11A1-208表达均增加(P<0.05),且SGC-7901细胞增加更多。见表1,表2。

表1 COL11A1-208在GC癌组织中的表达情况

表2 COL11A1-208在GC细胞中的表达情况

2.2 SGC-7901细胞成功过表达或敲低COL11A1-208

与Ctrl组、pcDNA3.1组、si-NC组比较,pcDNA3.1-COL11A1-208组SGC-7901细胞中COL11A1-208表达增加(P<0.05),与上述4组相比,si-COL11A1-208组SGC-7901细胞中COL11A1-208表达减少(P<0.05)。见表3。

表3 SGC-7901细胞成功过表达或敲低

2.3 过表达或敲低COL11A1-208对SGC-7901细胞增殖、侵袭和迁移的影响

与Ctrl组、pcDNA3.1组、si-NC组比较,pcDNA3.1-COL11A1-208组SGC-7901细胞增殖率、克隆数、侵袭数、划痕面积愈合率均增加(P<0.05),与上述4组相比,si-COL11A1-208组SGC-7901细胞增殖率、克隆数、侵袭数、划痕面积愈合率均减少(P<0.05)。见图1、2、3,表4。

图1 过表达或敲低COL11A1-208对SGC-7901细胞增殖的影响

图2 过表达或敲低COL11A1-208对SGC-7901细胞侵袭的影响(×400)

图3 过表达或敲低COL11A1-208对SGC-7901细胞迁移的影响

表4 过表达或敲低COL11A1-208对SGC-7901细胞增殖、侵袭和迁移的影响

2.4 过表达或敲低COL11A1-208对SGC-7901细胞增殖、侵袭和迁移相关蛋白的影响

与Ctrl组、pcDNA3.1组、si-NC组比较,pcDNA3.1-COL11A1-208组SGC-7901细胞中Ki67、Cyclin D1、MMP9、N-cadherin表达均增加(P<0.05),与上述4组相比,si-COL11A1-208组SGC-7901细胞中Ki67、Cyclin D1、MMP9、N-cadherin表达均减少(P<0.05)。见图4、表5。

图4 过表达或敲低COL11A1-208对SGC-7901细胞增殖、侵袭和迁移相关蛋白的影响

表5 过表达或敲低COL11A1-208对SGC-7901细胞增殖、侵袭和迁移相关蛋白的影响

3 讨论

GC是最常见的癌症类型之一,在中国每年约有38万GC新发病例,占全球每年癌症诊断总数的40%[12]。GC早期症状隐匿,侵袭转移较快,加之现有血清学肿瘤指标的敏感性和特异性都不高,导致GC患者预后较差,生存期较短[13]。因此,寻找新的肿瘤标志物,对GC患者的早期诊断、治疗和预后监测具有重要意义。

近年来,从基因层面寻找肿瘤标志物深受研究者青睐。人类基因组计划显示,编码蛋白质的基因只占整个基因组的2%,其余98%的基因被称为非编码RNA,根据转录本大小,可分为短非编码RNA和LncRNA,其中LncRNA占总RNA的68%以上[14]。LncRNA通过与多种蛋白及核酸相互作用参与细胞功能调控,已有大量研究表明LncRNA是诸多癌症的关键性调控因子,其异常表达与肿瘤的增殖、侵袭、转移和耐药等各种生物学行为有关,被认为是很有前景的诊断、预后生物标志物或治疗靶点[15-16]。以GC为例,如LOC285194通过抑制Wnt/β-连环蛋白信号通路抑制GC细胞增殖、侵袭,促进其凋亡[17];LINC00974通过上调细胞分裂蛋白激酶6促进GC细胞周期进展而加速GC细胞增殖[18];LINC00641通过海绵吸附微小RNA-429以Notch-1表达而促进GC的恶性进展[19];NR027113通过上皮-间质转化通路促进GC细胞侵袭和迁移,同时与GC患者淋巴结转移、远处转移及预后不良呈正相关[20-21]。

COL11A1-208为LncRNA家族新成员,有研究发现其在OSCC的发生和进展中发挥着重要的肿瘤促进作用,有望成为OSCC的一个潜在生物标志物[10-11]。而COL11A1-208在GC中的确切作用仍未可知。本研究结果显示,COL11A1-208在GC癌组织中及GC细胞(AGS、MGC-803、MKN-45、BGC-823、SGC-7901)中均高达,且在GC细胞中以SGC-7901细胞表达最高,提示COL11A1-208可能作为一种致癌基因参与GC的癌变过程。肿瘤的发生和进展是一个多因素、多步骤、渐进的过程,伴随着一系列基因表达异常,其中Ki67和Cyclin D1为评估细胞增殖状况关键的两个指标,二者的表达水平与细胞增殖活力呈正相关[22-23];MMP9是一种基质金属蛋白酶,可降解血管基底膜和细胞外基质而增强细胞的侵袭、迁移能力,N-cadherin是一种广泛存在于上皮组织中的钙黏附蛋白,主要通过介导细胞间的黏附而促进细胞侵袭和迁移[24-25]。本研究选取COL11A1-208表达量最高的SGC-7901细胞进行转染实验,结果发现过表达COL11A1-208后SGC-7901细胞增殖率、克隆数、侵袭数、划痕面积愈合率及Ki67、Cyclin D1、MMP9、N-cadherin表达均增加,即过表达COL11A1-208可促进SGC-7901细胞增殖、侵袭和迁移,而敲低COL11A1-208表达后SGC-7901细胞的增殖、侵袭和迁移能力下降,证实COL11A1-208作为一种致癌基因参与GC的癌变过程,但其具体的调控分子机制和临床潜力仍有待进一步探索。

综上所述,COL11A1-208在GC中高表达,其可促进SGC-7901细胞增殖、侵袭和迁移,COL11A1-208有望成为GC一个有前景的诊断、预后生物标志物或治疗靶点。