LAMR1和ENO1自身抗体对早期非小细胞肺癌诊断的价值

刘欣桐,金 鹏,张红梅,李 宁,刘倩倩,陈玉丙*

(1．南方医科大学深圳医院 临床检验医学中心,广东 深圳518000;2.吉林大学第二医院 肿瘤放疗科,吉林 长春130041;3.吉林大学中日联谊医院 科学研究中心,吉林 长春130033)

肺癌是最常见癌症,也是癌症死亡的首要原因。发生局域转移或远处转移后5年生存率只有27.4%和4.2%,早期诊断对提高非小细胞肺癌(NSCLC)患者生存率十分重要[1]。低剂量CT检查是成熟的早期筛查方法,然而有其局限性,如高假阳性率导致的额外有创检查或手术[2],进行筛查受到的电离辐射有增加癌症的风险[3]。

近年来,基于各类生物标志物的研究发展迅速,在早期肺癌筛查、肺内结节良恶性判断以及评估肺癌预后中占有重要地位。肿瘤相关抗原(TAAs)因其特殊的免疫原性,在肿瘤发生的早期阶段可被免疫系统识别并产生自身抗体[4],这使得自身抗体有望成为肿瘤早期筛查的潜在生物标记物,在多种恶性肿瘤的研究中已显示出早期诊断的价值[5-9]。本研究选取肿瘤相关抗原LAMR1和ENO1,应用其肽抗原检测并对比NSCLC患者和健康者之间相应自身抗体水平的差异,并进一步探究在早期NSCLC中的诊断价值。

1 材料与方法

1.1 基本信息

本研究收集了2014年9月至2016年12月于吉林大学第二医院新诊断的未经任何治疗的220例非小细胞肺癌患者血清为肺癌组,均有明确的病理诊断和分期。同时收集了性别、年龄相匹配的220例健康体检者的血清为对照组,见表1。

表1 入组人员基本信息表

1.2 ELISA检测自身抗体

应用免疫信息学数据库(IMGT 数据库、IMGT/HLA 数据库、T 细胞表位查询和预测数据库、HLA 表位结合预测工具)和免疫学软件设计并用固相合成法合成肽抗原(hAgs)。将重组抗原稀释至10 μg/ml,每孔加样100 μl,4℃过夜。弃去孔中液体,加洗液每孔200 μl,洗涤3次;将血清样品、阴性对照品(BSA分析液)和质控样品(200名健康者的混合血浆样品)在BSA缓冲液中1∶100稀释,室温(18～22℃) 下孵育1.5 h;洗涤3次后添加1∶20 000 倍稀释的过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体,每孔加样100 μl,室温下孵育1 h;洗涤3次后,每孔加TMB显色液100 μl,避光温孵育20 min;每孔加50 μl终止液,孔中反应液由蓝色变为黄色;5 min内使用酶标仪在450 nm处测定各孔吸光度。所有检测样本均设置双复孔,取双复孔的平均OD值作为结果,使用特异结合指数(SBI)表示血浆中的抗体水平:SBI=(OD hAg-OD NC)/(OD cAg-OD NC)。cAg为基于山羊α-乳清蛋白蛋白质序列设计的对照抗原,该蛋白质序列不含任何类似于源自其人配对物序列的HLA-II表位,NC为阴性对照。

1.3 统计学分析

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2 结果

2.1 LAMR1、ENO1自身抗体在NSCLC组和健康对照组中的水平

NSCLC患者血清中LAMR1、ENO1自身抗体水平均高于健康对照组,差异有统计学意义,P<0.05(表2)。

表2 NSCLC组和健康对照组血清中自身抗体的水平

2.2 LAMR1、ENO1自身抗体的检测用于早期NSCLC筛查

近年来,许多学者研究了TAAs的自身抗体在肺癌检测中的应用。CHERNEVA的研究显示α-crystallin自身抗体在癌症患者组敏感性为62%,特异性为72%,并可有效区分有无淋巴结转移[10]。Ma通过检测215例NSCLC患者血清中Survivin自身抗体水平发现NSCLC中Survivin自身抗体阳性率为19.5%,特异性88.9%,与CEA联合检测后阳性率提高[11]。本研究应用TAAs肽抗原检测结果显示NSCLC患者血清中LAMR1、ENO1自身抗体表达水平显著上调(P<0.05)。

易文芝[5]对益生菌发酵技术进行研究，发现菌株在37℃进行培养时，可以得到较高活菌数。张岩等人[6]研究发现乳酸乳杆菌在4℃的条件下进行保存可以得到最佳活菌数，对延长乳酸乳杆菌活力提供了有力的支持。李志成等人[7]研究发现不同发酵温度下所制得的冻干发酵剂活菌数均有很大不同，其中于30℃条件下进行发酵所制得的冻干发酵剂的活菌数最高。

表3 早期NSCLC患者血清中自身抗体水平

表4 LAMR1、ENO1自身抗体及其联合检测在早期NSCLC中的诊断性能

3 讨论

128例早期(Ⅰ和Ⅱ期)NSCLC患者血清中的LAMR1、ENO1自身抗体水平与健康对照组对比,显著上调,P<0.05(表3)。LAMR1、ENO1肽抗原对早期NSCLC检测的敏感性分别为70.3%(95%CI:61.5～77.9)、59.4%(95%CI:50.3～67.9),特异性分别为65.9%(95%CI:59.2～72.1)、81.8%(95%CI:75.9～86.6)。经分析,对早期NSCLC 的LAMR1、ENO1自身抗体联合检测,敏感性和特异性分别为75.8% (95%CI:67.3～82.7)、58.2% (95%CI:51.3～64.7),联合检测的敏感性高于单独检测(表4)。

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自身抗体在血液中持续存在并且相对稳定,TAAs出现后,在TAAs能够被检测到之前它们即表现出相应的有效生物学扩增,在第一临床症状出现之前的能够被CT筛查到的5年前,自身抗体便可被检测到[12]。

YAO等[13]研究发现DKK1自身抗体与NSCLC高度相关,ROC分析示自身抗体的灵敏度为62%,特异性为84%,检测I期NSCLC的敏感性为64.3%。本研究中LAMR1、ENO1肽抗原对早期NSCLC检测的敏感性分别为70.3%、59.4%,特异性分别为65.9%、81.8%。这表明在肿瘤发生的早期阶段,人体免疫系统识别肿瘤抗原,进行非常有效的生物学扩增产生自身抗体[14],使得TAAs的自身抗体具有作为早期筛查的潜能。

肿瘤的生物学行为十分复杂,是一个涉及多基因、多通路变化的结果[15],使用单一TAAs的自身抗体检测肿瘤的发生具有局限性,应用联合检测可以使诊断的敏感性增加。MEGLIORINO等[16]使用ELISA检测乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、食管癌等多种肿瘤患者c-myc、p53和survivin的自身抗体,敏感性分别为12.3%、11.5%和8.4%。将3种自身抗体联合检测时,敏感性增加至27.3%。本研究将LAMR1、ENO1自身抗体联合检测早期NSCLC,敏感性增加至75.8%。

综上,本研究选取肿瘤相关抗原LAMR1、ENO1,应用其肽抗原检测NSCLC患者自身抗体,在一定程度上解决了应用完整抗原[17-18]检测自身抗体敏感性低的难题,也显示出一定的早期诊断性能。但针对的NSCLC肿瘤相关抗原种类较多,筛选合理的抗原类别和组合是该类研究的难点。