不同香型白酒酿造过程乳酸菌的研究进展

阎春悦，利佳炜，张 茜，常 煦，陈 雄，李 欣*

（1.工业发酵省部共建协同创新中心，发酵工程教育部重点实验室，工业微生物湖北省重点实验室，湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北武汉 430068；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443000）

乳酸菌是一类利用碳水化合物发酵且主要产物为乳酸的革兰氏阳性菌的统称[1]，按照系统分类学，乳酸菌属厚壁菌门，分为4纲7目18科39属653种[5]。作为一种典型的功能酿造菌，在中国传统白酒酿造体系中，除细菌、酵母菌、霉菌等常见的白酒酿造微生物外，乳酸菌也是白酒酿造体系中的重要微生物之一。发酵过程中除了产生大量乳酸外，还伴随有酯类等风味物质的产生，既可以充分提升产品风味、香气感官特征，又可以抑制发酵前期部分杂菌生长，对维持酿造体系的生态环境起着重要作用[2-4]，同时对丰富白酒的风味和口感起着关键作用[6]。

中国白酒香型丰富，风味各具特色。不同香型白酒的酿造体系中均有着复杂且独特的微生物菌群。作为群落微生物成员之一，乳酸菌参与白酒酿造的规律已被逐渐认识[7]。乳酸菌群之间、乳酸菌与其他微生物菌群之间的相互作用共同影响着中国白酒的发酵风味[8]。众多研究者揭示了乳酸菌群在发酵过程中的丰度变化及其对风味物质的代谢功能对白酒挥发性风味产生的重要影响[9，14-17]。文章围绕酿酒微生物丰度、风味和代谢等方面，综述了近年来乳酸菌在4 种白酒香型（浓香型、清香型、酱香型、芝麻香型）发酵体系中的研究进展。

1 浓香型白酒中乳酸菌

1.1 乳酸菌在浓香型白酒中的相对丰度

浓香型白酒是中国传统典型的白酒香型之一，具有“醇香浓郁、甘洌清爽、回味悠久”的特点，一直以来深受大众的喜爱[10]。该香型白酒采用以高粱为主要原料的复杂的人为半开放固态发酵模式[11]。唐云等[12]通过高通量基因组提取和测序、OTU（Operational Taxonomic Units）划分、Alpha 多样性分析、Beta 多样性分析、分类学组成分析等方法，对甘肃陇南地区的金徽酒厂和四川某酒厂老车间不同窖龄的浓香型白酒窖泥中的细菌群落结构和多样性进行研究，发现在甘肃陇南的金徽酒厂（乳酸菌相对丰度8.11%～12.19%）和四川某老酒厂（乳酸菌相对丰度2.43%～6.12%）车间的窖泥中乳酸菌均是优势细菌菌株之一；杨阳等[13]探究贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）在浓香型白酒发酵中的作用，采用顶空固相微萃取气相色谱-质谱联用技术、斯皮尔曼（spearman）相关性分析等方法，对浓香型白酒的酒醅进行检测分析，结果显示试验组（加贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis）和对照组（不加贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis）中的乳酸菌属在发酵中期酒醅中的相对丰度均是较高比例，尤其是对照组酒醅发酵的第22 天乳酸菌属相对丰度达到了75.4 %；沈鑫等[14]对从浓香型白酒中筛选到的15 株菌进行分离鉴定，均被鉴定为乳酸菌属中的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）；栗连会等[15]在探究泸型酒（浓香型）中乳酸菌多样性和代谢特征时发现，发酵初期的乳酸菌相对丰度占窖泥总细菌数的50%，并且在发酵结束时达到了78%，成为了发酵体系中的绝对优势微生物；Zheng 等[16]采用系统生物学的方法分别对丰谷、剑南春两个不同酒厂发酵谷物进行微生物群落分布研究，Du 等[17]对中国白酒发酵过程中的关键风味生产者进行探究，均发现细菌中的乳酸菌属在白酒风味发酵中起主要作用。

1.2 乳酸菌对浓香型白酒中酿造代谢物和风味的影响

浓香型白酒酿造中的四大功能菌分别是细菌、酵母菌、霉菌和放线菌[18]，其中细菌是浓香型白酒香味物质的主要贡献者。浓香型白酒发酵中的细菌不仅能产生风味物质，还能产生一些帮助微生物菌群更好生长的酶类，如淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶等[19]。有些细菌可促进美拉德反应，为发酵产香味物质提供前体物质，促进酯类物质产生[10]。

固态发酵体系中的有机酸指乳酸、乙酸、丁酸等，其中乳酸占浓香型白酒总酸含量的52 %～91 %[20]。乳酸菌发酵所产生的乳酸通常是固态白酒发酵的主要乳酸来源。己酸菌发酵代谢产生己酸，己酸又与乙醇等发生一系列反应最终产生浓香型白酒的主要香味物质己酸乙酯[21]。己酸乙酯是浓香型白酒的主体香味物质，但在浓香型白酒中乳酸乙酯与己酸乙酯含量相当[20]。这两种酯在浓香型白酒的总体酯类物质中占龙头地位，酯类物质的含量可直接影响浓香型白酒的风味和品质，反映了乳酸菌在浓香型白酒发酵中的重要作用。杨阳等[13]通过对浓香型白酒窖泥中微生物分离鉴定发现乳酸菌为优势细菌属之一，并且己酸含量和乳酸菌的丰度呈显著正相关，证实了乳酸菌在白酒风味形成中有重要作用，且乳酸菌在浓香型白酒发酵体系中有利于维系有益微生物群落的平衡。乳酸菌不仅通过与己酸菌等酿造功能菌的相互作用促进浓香型白酒香味物质的产生，还能通过自身发酵产生的乳酸乙酯提升浓香型白酒风味。

栗连会等[15]采用菌群功能预测分析方法（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States，PICRUST）对酒醅微生物群落中乳酸菌的代谢功能进行预测，研究发现乳酸菌不仅可以较多的参与糖酵解途径，还能代谢生成以丙酸、丁酸、己酸和己酸乙酯为主的多种风味物质，其中合成能力较强的为Lactobacillus senioris；姚惟琦等[22]对干燥棒杆菌（Corynebacterium xerosis）、耳葡萄球菌（Staphylococcus auricularis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、腊状芽孢杆菌（Bacillus cereus group）、浸麻芽孢杆菌（Paenibacillus macerans）6 株产乳酸的细菌进行模拟固态发酵研究，发现6 株产乳酸细菌均会不同程度的抑制己酸、己酸乙酯以及乳酸乙酯的产量，甚至有一株巨大芽孢杆菌严重抑制了己酸乙酯的生成，对浓香型白酒风味产生不利影响。

2 清香型白酒中乳酸菌

2.1 乳酸菌在清香型白酒中的丰度

清香型白酒，亦称汾香型，以山西汾酒、汾阳王酒等为代表，属大曲酒类，具有清香纯正、醇甜柔和、自然协调、余味爽净等特点。大多数清香型白酒需要发酵两次，第一次发酵所得被称为大米查酒，第二次发酵得到二米查酒。Xue 等[23]采用高通量测序平台（Illumina MiSeq System）的高通量筛选方法，以16S rRNA 基因的V3-V4 区为测序目标，分析评估了清香型白酒发酵原料中细菌群落的结构和多样性，结果表明，乳酸菌是大米查酒发酵原料中的主要细菌，其相对丰度高达97.53 %。因为乳酸菌是大米查酒中的主要细菌，加上乳酸菌与有机酸、乳酸含量存在相关性，导致大米查酒比二米查酒pH 值更低，酸味更多。白酒的香型和风味与其发酵过程中微生物菌群的组成及其群落演替规律有着密不可分的联系[24]。乳酸菌和酵母菌分别是清香型白酒发酵功能菌中细菌和真菌中的优势菌属[25]，酵母菌在生长的同时其代谢产物为乳酸菌提供了生长所需的营养物质，乳酸菌的发酵反应又会促进风味化合物的合成。但并不是所有乳酸菌和酵母菌都可以产生正向的作用[26]。乳酸菌与不同种类功能菌之间的相互作用及演替规律是白酒发酵可产生不同风味物质的重要原因[27]。

2.2 乳酸菌对清香型白酒中酿造代谢物和风味的影响

清香型白酒与其他香型白酒使用的泥窖不同，其主要在陶罐中进行发酵。清香型白酒的主体香味物质是乙酸乙酯，占总体酯类物质含量的50%[20]。乳酸菌的发酵除了可以产生乳酸乙酯外，也会促进乙酸乙酯的生成。作为一种占总酸量75%～88%的有机酸[20]，乳酸在固态法白酒中具有促进新酒老熟的作用。清香型白酒酒体中易挥发的小分子物质可与乳酸通过氢键结合，一系列复杂的分子间反应可使酒体中的大小分子更容易形成胶体，该反应特点结合乳酸自身的稍涩、略酸、稍甜、柔和等特点可以缓和白酒的刺激感，进而使酒体呈现醇厚的口感。

在过去的几十年里，人们普遍采用高通量测序的方法来分析参与白酒发酵的微生物种类[28]。但这种分析方法不全面且无法精确提供微生物代谢的相关信息。黄晓宁等[29]基于鸟枪宏基因组测序，通过代谢组学分析发现不同的乳酸菌在清香型白酒发酵过程中起着不同的作用。乳酸菌发酵除产生乳酸外，还会产生乙醇、乙酸等副产物。乳酸和乙醇之间的生理生化反应又会进一步产生乳酸乙酯等香味物质。

庞晓娜等[30]采用多组学关联分析方法（Twoway Orthogonal Partial Least Squares，O2PLS）研究发现乳酸乙酯是清香型白酒风味物质中主要的酯类物质。乳酸菌在清香型白酒发酵中不仅可以代谢产生乳酸，也可以促进β-葡萄糖苷酶的产生[31]，β-葡萄糖苷酶可促进纤维素的水解产生更多的葡萄糖，同时还能提高萜类化合物的产量，有助于增强花香的风味特征[32]。在清香型白酒酒精生产阶段，乳酸菌又会参与丙酮酸代谢产生乳酸、乙酸和乙酰辅酶A 等物质。乳酸菌在清香型白酒生产过程中发挥着多种重要功能，但仍存在需要解决的问题，例如避免乳酸菌过度发酵产生过多乳酸等。熊君燕等[33]首次利用程序控温和固态发酵模拟清香型白酒发酵工艺，发现Pichia kudriavzeviiMJ14 可在一定程度上抑制乳酸菌过量产乳酸，这一发现为乳酸菌在清香型白酒发酵中更好的发挥作用提供了方向。

3 酱香型白酒中乳酸菌

3.1 乳酸菌在酱香型白酒中的丰度

酱香型又称茅香型，著名的代表是茅台酒，属大曲酒类。其具有酱香明显、酒体醇厚、挂杯均匀、入口香辣、回味悠长等特点[34]。Wang 等[8]采用16S rDNA高通量测序技术对华北地区的芦台春酱香型白酒不同批次发酵谷物进行微生物群落结构分析，研究发现在门的水平上壁菌门是芦台春白酒发酵主要细菌，其相对丰度高达96.81%，在属的水平上主要细菌是乳酸菌，其相对丰富高达66.5 %；李欣等[35]采用高通量测序技术对华南福建省酱香型白酒生产过程中发酵谷物的微生物多样性进行测序和分析，发现乳酸菌是酒窖发酵后期发酵谷物中的优势细菌。

茅台酒作为酱香型白酒的重要代表，窖池发酵是酱香型白酒生产中酒精积累的主要阶段，Hao 等[8]在研究中发现酱香酒窖池发酵过程中乳酸杆菌成为优势菌。随着酱香型白酒发酵过程中微生物群落的不断变化，乳酸杆菌、酵母菌和毕赤酵母成为发酵系统中的优势微生物。乳酸杆菌可以通过乳酸的代谢调节发酵谷物的酸度，并抑制杂菌的生长[36]。乳酸杆菌作为提高酸度的核心功能微生物，能够通过异源乳酸发酵产生乳酸、乙醇和乙酸[37]。吴莉莉[38]等采用PCR-DGGE（变性梯度凝胶电泳）技术分析酱香型和清香型白酒发酵体系中乳酸菌菌群的动态差异，在所有条件保持一致的情况下，发现酱香型白酒中优势乳酸菌种为Lactobacillus homohiochii，清香型白酒酒醅中的优势乳酸菌种则为Lactobacillus fuchuensis，反映了不同香型白酒中优势乳酸菌种不同。邵明凯[39]研究发现酱香型白酒随着发酵轮次不断增加，发酵体系中乳酸菌数量也不断增加，发酵到最后一轮时乳酸菌成为绝对优势菌。

3.2 乳酸菌对酱香型白酒中酿造代谢物和风味的影响

酱香型白酒有其独特的酿造工艺，与其他香型白酒酿造过程不同的是其高温制曲、高温堆积、高温发酵等特点。众多独特工艺流程共同影响着酱香型白酒的风味。白酒发酵过程中会产生一些酒精，许多细菌在酒精胁迫下很难生存，导致发酵后期酿造微生物大量减少，进而影响白酒品质。吴莉莉等[38]从酱香型白酒发酵谷物中筛选到两株高酒精耐受性的乳酸菌，分别是植物乳杆菌LTJ12 和嗜酸粒球菌LTJ28，经试验证明植物乳杆菌LTJ12 和嗜酸乳杆菌LTJ28 在8%酒精胁迫下的存活率分别为59.01%和55.50%。

酱香型白酒因其高温发酵的特点，发酵过程中生物热的积累窖泥温度最高可达45 ℃左右[40]，随着温度的不断升高，窖泥中可耐高温的微生物逐渐变为优势菌株，正是耐高温微生物之间的复杂相互作用赋予了酱香型白酒区别于其他香型白酒的独特风味与口感[41]。酱香型白酒大都是高浓度酒，水含量低，可游离的水分子较少，赋予了其“越陈越香”的特点，年份的增加会让酱香型白酒的酒体更加醇厚，这也是酱香型白酒相较于其他香型白酒储存期长的重要原因。此外酱香型白酒的风味和其窖池的年份也有一些关联，一般认为，窖池年份越久所酿造的白酒风味越丰富。监测酱香型白酒酒醅中乳酸的含量，发现乳酸含量和乳酸菌群丰度变化规律大体一致，说明乳酸的产生与乳酸菌群有着密不可分的关系，反映了乳酸菌在酱香型白酒中的重要作用。

4 芝麻香型白酒中乳酸菌

4.1 乳酸菌在芝麻香型白酒中的丰度

芝麻香型白酒以芝麻香为主体香味，同时兼有浓香型、清香型、酱香型3 种香型白酒的长处，是酱香型白酒的一支延伸香型，也是中国12 种香型白酒中较为“年轻”的成员。崔凤娇等[42]通过16S rDNA 高通量测序结合传统的微生物定量分析方法，测定了发酵过程中微生物群落结构的变化，发现发酵早期微生物群落以纤维素菌、维斯特氏菌和芽孢杆菌为主，发酵中后期以乳酸菌为主；邢敏钰等[9]结合高通量测序和实时荧光定量PCR 技术对芝麻香型白酒发酵过程中乳酸菌菌群演替进行跟踪定量分析，结果显示，芝麻香型白酒发酵过程涉及5 个属的乳酸菌，在窖池发酵过程中Lactobacillus属的乳酸菌逐渐成为优势细菌，尤其是Lactobacillus sp，在窖池发酵中后期相对丰度达到80%以上。

乳酸菌在芝麻香型白酒酿造中的碳水化合物和氨基酸代谢途径中占据着重要地位。王海燕等[43]利用PCR-DGGE、16S rRNA 基因文库发现耐酸乳杆菌随着发酵时间增加在芝麻香型白酒发酵后期成为优势细菌，猜测可能因发酵过程中乳酸的不断积累导致发酵环境的pH 值降低，pH 值的降低破坏了其他微生物最适生长的条件最终导致乳酸菌占上风。邢敏钰等[9]通过对16S r RNA 的测序结果进行比对分析，发现在芝麻香型白酒发酵过程中厚壁菌门（Firmicutes）占细菌总量的94 %以上，其中乳酸菌是发酵过程中的绝对优势细菌，包括Weissella、Pediococcus、Lactobacillus、Leuconostoc、Lactococcus等5个属。

4.2 乳酸菌对芝麻香型白酒中酿造代谢物和风味的影响

白酒酿造的原料是高粱等谷物，其主要成分是淀粉，淀粉水解产生糊精、葡萄糖等物质。绝大多数可培养乳酸菌能够很好地利用葡萄糖。杜海等[44]通过可培养的手段,从芝麻香型白酒酒醅中分离筛选出32 株乳酸菌，研究发现这些可培养乳酸菌普遍能够利用葡萄糖,但对糊精等其他物质的利用能力差异比较大。相较于Pediococcus，Lactobacillus对糊精的利用能力较好。Lactobacillus良好的糊精利用能力，为其在窖池发酵中后期葡萄糖较少的情况下仍能大量生长提供了保障。王鹏等[45]采用PLS 相关性分析的方法，发现芝麻香型白酒酿造中乳酸菌的丰度与酸、醇、酯等风味物质为正相关关系。乳酸菌代谢产生的乳酸、乙酸等有机酸既可以直接影响白酒风味的形成，还能够以其为底物产生乳酸乙酯、乙酸乙酯等酯类物质对白酒风味产生影响。

5 总结与展望

乳酸菌在不同香型白酒发酵体系中发挥着自身独特作用，如乳酸菌为风味物质（如酯类物质）提供前体原料；维持发酵体系的低pH 值，抑制白酒发酵前期杂菌的生长；对发酵原料中的淀粉水解物（如糊精）有着较好的利用能力等。乳酸菌群与其他微生物菌群之间的相互作用影响不同香型白酒的发酵过程。乳酸菌已被证实在中国白酒发酵中有着重要作用，不同种乳酸菌在不同香型发酵体系中发挥的作用各不相同，甚至同一种香型白酒发酵体系中不同的酒醅处理方式也会影响优势乳酸菌的种类。然而，对白酒酿造乳酸菌的研究还有很多工作需要开展，如对不同纯种乳酸菌的具体功能和代谢特征了解还不够精细；新型纯种优良的白酒酿造乳酸菌（如耐酸、耐高温、耐乙醇等新功能或特性）菌株还有待充实；乳酸菌与酿造体系中其他微生物在不同酿造阶段的影响研究不够深入等。随着对乳酸菌与酿造微生物互作关系的深入研究，将会为定向调控白酒风味，促进中国白酒自动化生产提供新的思路和方向。