烟草番茄环纹斑点病毒快速检测试纸条的研制及应用

姜 宁，夏振远，卢灿华，黄昌军，马俊红，刘春明，盖晓彤*

1.云南省烟草农业科学研究院，昆明市五华区圆通街33 号 6500212.云南省烟草公司红河州公司，云南省红河州弥勒市温泉路 652399

番茄环纹斑点病毒（tomatozonatespotvirus，TZSV）属于正番茄斑萎病毒属（Orthotospovirus），是正番茄斑萎病毒属的一个新种，于2005 年在我国云南省的番茄和辣椒产区中被发现，由Dong 等［1］分离并正式命名。TZSV 自然条件下可侵染番茄（Lycopersicumesculentum）、辣椒（Capsicumannuum）、普通烟草（Nicotianatabacum）、马铃薯（Solanum tuberosum）、文殊兰（Crinumasiaticum）、蜘蛛兰（Hymenocallislittoralis）、鸢尾（Iristectorum）、鬼针草（Bidenspilosa）等20多种植物，目前主要分布在我国的云南、广西等地［1-8］。TZSV 主要以西花蓟马（Frankliniellaoccidentalis）、棕榈蓟马（Thripspalmi）、烟蓟马（T.tabaci）等多种蓟马为介体，通过持久增殖型的方式进行传播，同时还可以通过嫁接和汁液摩擦传播［1，9-12］。该病毒可引起多种经济作物斑萎病，常与其他病毒复合侵染加重症状，严重时甚至绝收，给农业生产带来较大经济损失［13-14］。TZSV 在寄主上引起的症状主要与品种、寄主生育时期、环境条件等因素有关。受TZSV侵染的烤烟烟株在发病初期，叶片上会出现同心环纹或细小坏死斑点，随后坏死范围扩大，叶片上出现大量坏死环斑或连片坏死，主叶脉扭曲，植株顶芽坏死萎蔫，在团棵期以前发病的烟株常整株坏死［13，15-16］。根据于海芹等［2］的报道，云南省烟草斑萎病发病烟株中，27%以上由TZSV 引起，TZSV 已成为云南烟区烟草斑萎病的主要病原，严重影响烤烟生产。然而，其在烟草上引起的症状与番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV）等正番茄斑萎病毒属病毒在烟草上引起的症状相似，通过肉眼难以辨别。目前，检测TZSV 的方法主要有电子显微镜检测［17］、分子生物学检测［4，18］、血清学检测等［19-21］。电镜检测、分子生物学检测，以及血清学检测中的酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测耗时长，且需要专业检测设备和技术娴熟的专业人员，成本高，不适合田间病害的快速检测［22］。目前，国内科研人员制备了TZSV 的单克隆抗体［19-21］，并在此基础上制备了TZSV 的胶体金免疫层析试纸条（colloidal gold immunochromatographic strip，GICA），然而目前国内外市场上并没有商品化的TZSV检测试纸条。为此，制备了TZSV N蛋白单克隆抗体，并研制了能够快速检测TZSV 的胶体金试纸条，旨在实现烟叶生产中TZSV的快速检测鉴定，为烟草斑萎病的有效防控提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

试剂耗材：酵母提取物、胰蛋白胨、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷［IPTG（英国OXOID公司）］；BL21 感受态（自制）；预染蛋白Marker、蛋白浓度定量试剂盒（上海生工生物工程有限公司）；牛血清白蛋白BSA（美国Merck 公司）；碳酸氢钠、无水碳酸钠、氯化钠、氯化钾、十二水合磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、碳酸钾、Tris、柠檬酸、氯金酸、柠檬酸三钠、蔗糖、海藻糖、氢氧化钠、吐温-20、甲醇等（国产分析纯）；NC膜（德国Sartouris公司）。

仪器：超声波细胞破碎仪（美国Branson 公司）；全温度振荡培养箱（上海旻泉仪器有限公司）；高速冷冻离心机、低温高速离心机、可调微量加样器、小型台式离心机（德国Eppendorf公司）；恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；恒温鼓风干燥箱（德国Binder 公司）；纯水仪（美国Millipore 公司）；水平摇床（太仓华利达实验设备有限公司）；pH 计（瑞士Mettler Toledo 公司）；喷金划膜机、切条机、压卡机、封口机（杭州峰航科技有限公司）。

病毒材料：采自云南植烟区玉溪、红河、昆明、丽江、临沧、普洱、文山、昭通、曲靖等州（市）的田间发病烟叶样品131个，样品经PCR检测为TZSV阳性后用于试纸条的检测。烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）、马铃薯Y 病毒（potato virus Y，PVY）、TSWV、南美红辣椒脉斑驳病毒（chilli veinal mottle virus，ChiVMV）、黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、烟草脉带花叶病毒（tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV）等均由本课题组纯化保存。

1.2 方法

1.2.1 TZSVN基因蛋白表达和纯化

序列合成：根据TZSV 云南分离物N基因序列（GenBank Accession number NC_010489），优化密码子，合成并克隆到载体pET28a，得到质粒pET28a-TZSV-N，序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。质粒pET28a-TZSV-N 转化大肠杆菌BL21（DE3），并筛选阳性克隆。

蛋白表达：固体平板上挑取pET28a-TZSV-N 单克隆菌落接入5 mL LB 液体培养基（卡那质量浓度50 μg/mL），37 ℃培养12～14 h。次日，菌种以1∶50（体积比）接入LB 液体培养基（卡那质量浓度50 μg/mL），37 ℃培养至OD值0.4～0.6，加入IPTG至终浓度0.8 mol/L，25 ℃诱导表达6 h，菌液8 000 r/min、4 ℃离心（5810R，德国Eppendorf 公司）15 min，并收集菌体。

菌种裂解：加入100 mL 破碎液进行超声破碎。裂解条件：冰浴、功率60%、超声2 s、间隔2 s、时间15 min。超声破碎后12 000 r/min、4 ℃离心15 min，并收集上清液和沉淀。

上清液纯化：收集的上清液利用高亲和性Ni 树脂进行纯化，并收集穿出液、洗脱液，由SDS-PAGE检测纯化效果。

1.2.2 杂交瘤细胞和单克隆抗体制备

将表达纯化的蛋白与等体积的弗氏佐剂混合乳化均匀，成油包水状态，用于免疫小鼠试验。将乳化后的蛋白免疫4只BALB/c小鼠，皮下免疫3次，间隔28 d，最后经间接ELISA 检测效价［23］。细胞融合参照赵丹丹等［24］的方法，最后一次免疫14 d 后腹腔注射抗原进行加强免疫，3 d后进行细胞融合。将融合好的细胞进行96 孔铺板，用HAT 培养液进行培养，3 d后更换并改用HT培养液培养。10 d后，取细胞培养上清液进行检测。使用有限稀释法对阳性孔进行克隆，直到得到的克隆均为阳性，最终获得杂交瘤细胞。

提前7 d在小鼠腹腔中注射矿物油，将一定数量的杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔，10 d左右收集腹水，4 000 r/min 离心15 min，上清液即为单克隆抗体腹水。参照尚海丽等［25］的方法进行单克隆抗体纯化。以间接ELISA方法对纯化后抗体进行效价检测［23］。

应用小鼠抗体亚型检测试剂盒（美国Proteintech公司）对抗体进行亚型检测。应用双抗夹心的金标方法筛选可以配对的抗体对。

1.2.3 TZSV胶体金快速检测试纸条制备

参照魏梅生等［26］的方法，采用柠檬酸三钠还原方法制备胶体金。TZSV 胶体金快速检测试纸由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫（吸收垫）和背板组成；样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次叠加粘贴在背板上，各组分间相互叠加2.5 mm；金标垫上包被有胶体金标记的抗TZSV单克隆抗体（由10#杂交瘤细胞产生）；硝酸纤维素膜上设有检测线（Test line，T线）和质控线（Control line，C线），检测线包被有抗TZSV病毒单克隆抗体（由55#杂交瘤细胞产生），质控线包被有抗鼠IgG二抗。

质控线包被的抗鼠IgG 二抗的质量浓度为1 mg/mL。样品垫的大小为3 mm×15 mm，金标垫的大小为3 mm×3 mm，硝酸纤维素膜的大小为3 mm×28 mm，吸收垫的大小为3 mm×19 mm。检测线与质控线间的间距为6.0 mm～6.5 mm。

在底板上依次粘贴样品垫和固定有胶体金标记的TZSV单克隆抗体的金标垫、硝酸纤维素膜以及吸收垫，切条机裁切成3 mm 宽，获得TZSV 胶体金快速检测试纸条。

1.2.4 检测方法

准备待测样品液，取200 μL 待测液加入1.5 mL离心管，取试纸条将有样品垫的一端插入离心管，接触待测液，5 min 左右判断结果。若C 线显色而T 线未显色，则结果为阴性；若C 线和T 线均显色，结果为阳性；若C线和T线均未显色或T线显色而C线未显色，则结果无效。

1.2.5 试纸条性能评价试验

1.2.5.1 灵敏度测试

将0.1 g 感染TZSV 的烟草叶片充分研磨，加入1 mL 0.1 mol/L PBS作为病毒汁液的10倍稀释液，依次配制102、103、104、105倍的病毒汁液稀释液。

1.2.5.2 特异性测试

将含TMV、PVY、CMV、TVBMV、ChiVMV、TSWV和TZSV的发病叶片制备成10倍病毒汁液稀释液，分别取200 μL用TZSV快速检测试纸条检测。

1.2.5.3 田间样品检测

田间采集疑似烟草斑萎病的样品，提取RNA，RT-PCR 鉴定其中的TZSV，所用引物为TZSV N 基因特异性引物。上游引物TZSV-N（5'-3'）：TTAAAA AGACAGATCATTGCTGCT；下游引物TZSV-NR（5'-3'）：ATGTCTAACGTCCGGAGTTTAAC，参考尹跃艳等［27］的方法设计。用TZSV 试纸条对所有TZSV RT-PCR 检测为阳性的样品进行测试，并计算两种检测方法的符合度。

1.2.5.4 稳定性测试

将制备好的TZSV快速检测试纸条密封后在4、25、37 ℃3个温度条件下保存，并在第0、1、2、3、4、5、6个月后取出，分别检测TZSV阳性样品和健康烟叶（阴性对照），并检测其稳定性。

2 结果与分析

2.1 TZSV云南省株系N蛋白原核表达

对TZSV云南株系N蛋白序列的亲疏水性、信号肽、跨膜域、基本结构等进行理论评估，为了更好地进行原核表达，对该基因序列进行了密码子优化（图1）。优化后的序列与原序列相比，核苷酸同源性为77.6%，而氨基酸序列完全一致。采用基因合成的方式构建质粒并克隆到表达载体pET28a上，进一步转化到大肠杆菌感受态细胞（BL21）。

融合蛋白经过纯化，可在上清液中大量表达，经验证在200～500 mmol/L 咪唑的洗脱下可最大量纯化该融合蛋白。SDS-PAGE 电泳分析在理论分子量35 kDa 相应位置出现明显条带，初步确定融合蛋白成功得到了纯化（图2）。

图2 SDS-PAGE检测纯化后的重组TZSV N蛋白Fig.2 Purified recombinant TZSV N protein after SDS-PAGE test

2.2 TZSV单克隆抗体制备

取4 只6 周龄雌性BALB/c 小鼠，在第0、13、33天共进行3次免疫。每次每只小鼠抗原免疫用量为25 μg，初次免疫用等量弗氏完全佐剂乳化，皮下多点注射。第2次免疫用等量弗氏不完全佐剂乳化，皮下多点注射，第3次免疫用等量生理盐水混合，腹腔注射。第2 次免疫后20 d 尾静脉采血，通过间接ELISA 法测抗体效价，以此确定小鼠体内是否有抗体生成。比较4只小鼠的效价，选择抗体效价较高的小鼠用于细胞融合。融合前3 d 用抗原直接加强免疫1次。

共获得阳性单克隆杂交瘤细胞株55 株（1#～55#）。收集杂交瘤细胞，制备并收集小鼠腹水，田间采集的TZSV阳性样品以103倍病毒汁液稀释液为待测样品，采用间接ELISA法测定抗体效价，效价最高可达1∶1 024 000。抗体类型及亚类鉴定结果表明，55 个单抗中有54 个单抗类型为IgG1，1 个单抗类型为IgG2b，所有单克隆抗体均为κ轻链。选择其中能够高效分泌TZSV 单抗且效价高的9#、10#、45#和55#杂交瘤细胞进行后续试验。

2.3 TZSV试纸条性能测试

按照1.2.3 的方法制备TZSV 快速检测试纸条。首先对试纸条灵敏度进行检测。经测试，10#单抗标金/55#单抗喷膜抗体组合检测效果最好。利用田间发病的TZSV 阳性烟叶样品进行灵敏度检测。结果（图3）显示，10#单抗标金/55#单抗喷膜的试纸条灵敏度最佳，在病毒汁液稀释104倍时T 线仍清晰可见，病毒汁液稀释105倍时隐约有线。

图3 TZSV试纸条灵敏度检测Fig.3 Sensitivity evaluation on test strips for TZSV

以阳性的TMV、PVY、CMV、TVBMV、ChiVMV、TSWV 和TZSV 发病叶片作为待测样品对TZSV 试纸条特异性进行检测，结果见图4。由图4 可见，试纸条仅对TZSV样品有阳性反应，其他病毒阳性样品检测结果均为阴性，表明TZSV试纸条具有良好的特异性。

图4 TZSV试纸条特异性检测Fig.4 Specificity evaluation on test strips for TZSV

田间采集疑似烟草斑萎病的烟草样品，提取RNA，通过RT-PCR 鉴定其中的TZSV。鉴定为TZSV 阳性的131 个烟草样品用本研究中制备的TZSV快速检测试纸条进行检测，其中126个样品经试纸条检测为阳性，符合率为96.2%。

TZSV 试纸条稳定性评价。将试纸条置于4、25、37 ℃环境条件下保存6个月，期间每隔1个月取出试纸条检测阴性对照和TZSV 阳性样品，结果见表1。在稳定性评价6 个月时间内，试纸条在3 种温度条件下均保持良好的稳定性，无假阳性和假阴性出现。

表1 不同温度条件下TZSV试纸条稳定性检测结果①Tab.1 Stability evaluation results of test strips for TZSV at different temperatures

3 讨论

烟草斑萎病已成为影响我国西南烟区烤烟生产的重要病毒病，其病原是以TSWV 和TZSV 为主的多种正番茄斑萎病毒属病毒［2］。不同病毒引起的烟草斑萎病症状类似，仅凭肉眼难以区分。此外，苗期的烟草斑萎病检测对于育苗质量监测尤为重要。目前市场上已有TSWV的快速检测产品，但没有TZSV的快速检测试纸条。我国已有科研人员制备了TZSV单克隆抗体并制备了TZSV快速检测试纸条，但其对烟草病汁液的检测限介于1∶810～1∶2 430，且并未对田间自然发病的TZSV烟叶样品进行检测［19-21］。本研究中制备的TZSV 快速检测试纸条检测TZSV阳性烟草叶片病汁液可稀释10 000 倍（质量体积比），灵敏度高，可在5 min内实现田间发病烟草斑萎病样品的快速检测。本研究中制备的TZSV 快速检测试纸条检测结果与RT-PCR 检测结果的吻合率为96.2%，少量RT-PCR检测结果为TZSV阳性的样品，TZSV试纸条检测结果为阴性，这说明试纸条检测的灵敏度略低于RT-PCR。由于病毒在叶片上分布不均，这一结果也可能与不同采样烟叶部位病毒含量差异有关。根据云南省烟草斑萎病病原组成特点，下一步可尝试制备同时检测TSWV 和TZSV 的多重检测试纸条。本研究中制备的TZSV 快速检测试纸条可对田间烟叶和烟田周边杂草上的TZSV 实现快速检测，基于其较高的灵敏度，本研究中制备的TZSV 单抗和快速检测试纸条具有检测传毒昆虫蓟马是否带毒的潜力，但还需进一步验证。

4 结论

①获得了TZSV 单克隆抗体。②制备了TZSV胶体金快速检测试纸条，可在5 min内完成烟草病毒的检测。③试纸条检测阳性TZSV 的烟草病汁液的灵敏度高，可稀释10 000 倍（质量体积比）。同时与烟草上常见的TMV、PVY、CMV 和TSWV 等病毒没有交叉反应，可特异性地检测田间烟叶样品中的TZSV。