脱水剂中添加伊红在肾活检病理组织标本预染色中的应用

成俊，叶琼瑶，吕漪妮

浙江省台州医院 （浙江台州 317000）

肾活检病理是诊断肾脏疾病的常用手段，通过判断肾活检组织学改变对疾病类型命名，如膜性肾病、局灶节段性肾小球硬化等，均通过病理组织诊断，所以肾活检病理组织标本的制作质量与疾病诊断的准确性紧密相关。染色不清晰、切片不够薄等都会导致诊断错误，对患者身心造成严重损害[1-2]，所以应重视肾活检病理组织标本的处理环节。随着现代病理技术的不断发展，脱水—透明—浸蜡等前期病理组织标本处理均已实现自动化。另外，肾活检病理组织标本为包埋工作中常见的一种标本，包埋石蜡颜色相近的大标本和小标本，极易混淆技术员的判断，一旦遗漏将造成严重医疗事故。因此，如何高质量、高效率地切片成为病理技术与病理诊断的关键[3]。本研究基于Leica ASP300 S 脱水机的使用方法，对脱水机脱水剂中添加醇溶性伊红试剂在肾活检病理组织标本中的预染色情况进行分析，探讨其可行性与临床价值，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源

选取2023 年1—3 月我院病理科肾活检病理组织标本44 例为研究对象。病理组织取材过程由专业技术员到场，处理穿刺获取的组织时动作应轻柔，不得出现外力牵拉、用力挤压等情况。在蜡板上进行组织分取，并用刀片快速切割。用含固定液和0.9%氯化钠注射液的镊子将病理组织块转移到固定瓶中。

1.2 试剂与仪器

本研究使用的试剂与仪器见表1。

1.3 脱水机的使用方法

Leica ASP300 S 脱水机主要由显示器、脱水缸、液位传感器、石蜡缸、试剂橱、活性炭滤网、收集盘、石蜡和试剂外接排液口、脱水篮构成[4-5]。开机后需在管理员模式下进行仪器设置，包括语言、时间、温度、运行顺序、试剂位置等方面。仪器设置后需进行试剂与石蜡填充，填充结束后更改试剂状态，将所有填充的试剂与石蜡均设置为满。每日运行程序前，对脱水缸的清洁度、试剂与石蜡的充足情况进行检查。包埋结束后清洗脱水缸，每周检查冷凝瓶和滴液盘，每3 个月更换1 次活性炭滤网[6]。使用过程中需注意，不可用附带塑料刮铲以外的材料清洁脱水缸、石蜡缸、密封圈；每次包埋后脱水篮和包埋盒须进行1 次标准清洗；使用金属包埋盒须使金属面保持朝向一致，放入脱水缸后，金属盖面须背离液位传感器；脱水后须检查整个运行流程是否报错；试剂运行过程中出现报警状况须及时联系工作人员或查阅说明书[7]。

1.4 肾活检病理组织标本预染色步骤

本研究中的固定、脱水、透明、浸透等一系列步骤均在Leica ASP300 S 脱水机中实施。（1）固定。固定光镜标本，需使用固定液，常用10%的中性缓冲福尔马林固定液。配方为100 ml 的40%甲醛、900 ml 蒸馏水、4 g 磷酸二氢钠、6.5 g 磷酸氢二钠，固定5 h 即可[8]。（2）前期处理。第一步为脱水，目的是去除病理组织上固定的和水洗过程中组织所含的水分，方便后续透明与浸蜡流程操作。病理科常用的脱水剂为丙酮和乙醇，丙酮脱水能力更强，但易使组织收缩变脆，常用于快速脱水，所以本研究采用乙醇进行脱水处理。为彻底脱水，一般采用不同浓度梯度的乙醇溶液。Leica ASP300 S脱水机可实现全自动脱水，减少客观失误，优化实验流程。第二步为透明，目的是方便病理组织石蜡包埋，因为组织脱水后使用的脱水剂无法与石蜡混合，所以需通过透明剂进行浸蜡。透明剂不但能与脱水剂进行混合，还能与石蜡混合，去除脱水剂后，可取代脱水剂进行浸蜡。当组织被透明剂全部占有时，会呈现不同程度的透明状态。透明剂一般不溶于水，常见的有二甲苯、甲苯、苯、氯仿、丁香油等。本研究使用二甲苯作为透明剂，不但价格低廉，而且透明力强，缺点是易使组织收缩变硬，所以透明时间不宜过长[9]，需在显示器模块设置相应时间。第三步为浸蜡，组织病理标本经脱水、透明后，要使石蜡支持剂进入组织内部，使组织变硬，并使石蜡取代组织中的透明剂，变为有硬度的蜡块，方便技术员实施切片处理。根据室温选择石蜡，室温高时选择熔点较高的石蜡，室温低时选择熔点较低的石蜡。第四步为切片，对蜡块进行连续切割，常规肾活检病理切片厚度为4～5 μm，特殊染色切片厚度则需保持6 μm 左右[10]（人工处理）。（3）染色。伊红试剂预染色原理：采用伊红试剂对肾活检病理组织标本进行预染色是常用的组织学染色方法，通过对细胞质与细胞核着色，进而观察细胞结构和功能。伊红试剂作为酸性染料，对细胞质和细胞间质具有亲和力，通过与细胞组织中的嗜伊红颗粒结合，形成盐类或络合物，从而使细胞组织呈现红色[11]。预染色的步骤如下：选取常规前期处理的肾活检病理组织标本，用水洗去固定液；用95%的乙醇进行脱水，再用苯酚或苯酚-甲醛混合液清除脱水剂，使组织细胞保持透明；用伊红试剂对细胞组织进行染色，用乙醇或乙醇-苯酚混合液洗去多余的伊红试剂，再用苯酚或苯酚-甲醛混合液清除洗涤剂，使组织细胞保持透明；覆盖标本，进行镜检[12]。

肾活检病理既要观察组织标本细胞结构，也要观察基底膜病变，所以常用苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色法[13]，本研究只研究伊红试剂的染色情况。脱水机试剂缸见图1。

图1 脱水机试剂缸

1.5 方法

肾活检病理组织标本固定5 h 后，将44 例标本随机分为4 组，每个缸位各放置4 例病理标本，对照组浸蜡切片后进行镜检。实验组与空白对照组染色后进行镜检。实验组和空白对照组处理方式见表2。

表2 两种染色处理方式

2 结果

肾活检病理组织标本的处理和制作对肾脏疾病的诊断与治疗发挥着关键作用，对操作人员的技术要求较高[14]。Leica ASP300 S 脱水机整个固定、脱水、透明、浸透过程在密闭环境中进行，可批量处理300 个病理组织标本。

本研究通过了解Leica ASP300 S 脱水机的工作方式，对肾活检病理组织标本进行采集、固定、脱水、染色等一系列操作，发现脱水后肾活检标本细胞质均呈现不同程度的颜色，其中4%或6%浓度的伊红试剂加入无水乙醇中染色1 h 后情况最佳。无论是大标本，还是小标本，颜色均比早期石蜡标本（空白对照组）更易识别。实验组处理的肾活检病理组织切片染色清晰、结构分明，均无脱水不彻底或组织发白等情况。而经过二甲苯脱蜡和乙醇水化等处理后，组织上的着色易被清洗，对后续HE 染色、免疫组化、特殊染色均无影响，染色情况见表3。

表3 各组预染色情况比较

3 讨论

提高肾活检病理组织标本的染色质量和稳定性，是确保病理诊断结果准确的关键，肾活检病理组织颜色与蜡块颜色相似，在处理大、小标本时，不利于病理观察，所以必须对病理组织标本进行染色[15]。常规染色方法有多种，本研究在了解Leica ASP300 S 脱水机运作方法的基础上，对伊红试剂在肾活检病理组织标本预染色中的应用进行了实验。伊红试剂是一种常用的染色剂，可用于显示细胞核和细胞质的结构。伊红试剂的浓度可对染色效果产生重要影响，浓度过高或过低均会导致染色不均匀或不清晰。本研究结果显示，4%或6%的醇溶性伊红试剂和无水乙醇的肾活检病理组织标本预染色1 h 后效果最好，颜色呈鲜红色和艳红色，与包埋用的白色石蜡形成鲜明对比，更有利于后续包埋与切片观察，且伊红试剂相对廉价、易得。汪洁等[16]的研究发现，伊红试剂可使组织标本呈艳红色，与包埋用的白色石蜡形成鲜明对比，可行性高。许波[17]发现，采用改良的HE 染色法可提升宫颈组织石蜡切片染色的一致性，从而提升病理组织切片的质量和诊断精准度。胥玲芬[18]验证了不同酸度的伊红试剂对病理组织标本预染色的效果，冰醋酸酸化伊红试剂的病理组织标本预染色制作效率相对更高，推广性更强。以上研究结果与本研究相似，均表明伊红试剂有利于后续包埋和切片观察。

伊红试剂的染色机制是通过与组织中的蛋白质和多糖形成氢键和范德华力而结合。伊红试剂的浓度会影响染色效果，因为不同浓度的伊红分子在组织中的分布和结合程度也不同[19]。一般来说，浓度过高或过低都会影响染色效果。浓度过高会导致伊红分子堆积在组织表面，而浓度过低会导致伊红分子无法充分与组织渗透和结合。因此，要实现最佳染色效果，需选择适当的伊红浓度。刘微[20]分别使用30%、20%和5%的伊红试剂对脂肪组织、子宫内膜制片等进行染色，发现5%浓度时的染色可提高病理诊断符合性，与本研究结果相似。染色时间是另一个影响染色效果的重要因素，因为染色时间决定了伊红分子在组织中的停留时间和结合程度。如果染色时间过短，伊红分子无法与组织充分渗透和结合，导致染色不均匀或不明显。如果染色时间过长，伊红分子可能与组织过度渗透和结合，导致染色过深或模糊。李金龙等[21]的研究结果表明，用0.8%伊红试剂对肾组织染色1 min，结果染色评分为7～9 分，与本研究结果存在偏差。其原因可能为，其染色试剂中除伊红试剂外，还有苏木精试剂，缩短了染色时间。王剑等[22]在Leica PELORIS Ⅱ全自动组织脱水机中添加了0.2～0.4 g/L的伊红试剂，脱水1 h 后发现得到的组织标本颜色艳红，便于后续包埋切片实验，与本研究结果相似。以上研究结果进一步佐证了伊红试剂在病理组织标本预染色中的可行性和临床价值。

综上所述，本研究使用Leica ASP300 S 脱水机的自动化固定、脱水、透明、浸透流程，进一步提高了病理科工作效率。但本研究也存在一定不足，如病理组织标本单一、操作流程过于简单、染色技术受限等，在后续研究中，可适当增加病理组织标本量，验证伊红试剂预染色效果的通用性，同时适当增加染色操作的多样性，发现更多优化流程方法。