NEAT1对宫颈癌发生的影响及机制

唐阳芳,张少华,陈国平

(西安医学院第一附属医院妇科,西安 710077;*通讯作者,E-mail:zhangshaohua72@163.com)

宫颈癌是全球第四大最常见癌症,也是女性癌症死亡的第四大原因,2020年全球宫颈癌的发生率约6.5%,死亡率约7.7%,估计有60.4万例新增病例和34.2万死亡病例[1]。在我国,每年宫颈癌新发病例约13万人次,占全球总体新发病例的28%,其中死亡病例约为5.3万[2],因此,对宫颈癌的防治是公共卫生领域的工作重点。人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是一种双链环状DNA病毒,目前已报道有 120多种基因型,是导致宫颈癌发生的主要高危因素[3]。单独的HPV感染不足以导致宫颈癌,基因改变和转录异常同样发挥着重要作用[4]。非编码RNA(ncRNA)包括微小RNA(miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNA)等,在mRNA翻译、RNA加工等生理过程中起重要作用,在宫颈癌等肿瘤的发生发展中亦扮演着重要角色[5]。

一种组织特异性的称为核内富集转录物1(NEAT1)的lncRNA在多种恶性肿瘤中表达异常[6],也是乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌等女性肿瘤的新型生物标志物[7]。miRNA是生物体内重要的转录后调控子,与宫颈癌细胞增殖、凋亡、侵袭、转移以及血管生成等过程密切相关,扮演着癌基因或抑癌基因的角色[8,9]。miR-34家族由miR-34a、miR-34b和miR-34c的5p和3p链组成,miR-34a-5p可显著抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和细胞侵袭[10]。本研究旨在体外观察NEAT1对宫颈癌细胞增殖、凋亡、侵袭和转移功能的影响,并验证其与miR-34a的靶向关系,有助于我们寻找有效的宫颈癌治疗分子靶标。

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 细胞培养

将EEC和HeLa细胞从液氮中取出,快速放入37 ℃水浴锅中,轻摇冻存管使冻存液溶解;溶解后把细胞转移到含有5 ml MEM培养基的离心管中,离心收集细胞(1 000 r/min 离心5 min),弃上清;用含10%胎牛血清的完全培养基悬浮细胞,接种到培养皿中,轻轻吹打混匀,37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养。细胞的密度达到80%时,弃去培养基,用PBS洗一遍;加2 ml胰蛋白酶消化细胞,显微镜下观察,消化2 min,可看到细胞相互分离变圆,即消化完成;快速弃去胰酶,加入完全培养基,吹打细胞,制成单细胞悬液,按1∶3的比例传代,37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下扩大培养。

1.3 实时荧光定量PCR检测NEAT1、miR-34a-5p的基因表达

Trizol法提取EEC及HeLa细胞的总RNA后,去除基因组DNA,配制逆转录反应体系,逆转录获得cDNA作为反应模板。利用合成的引物序列,在ABI proFlex实时荧光定量PCR扩增仪上进行反应。用于检测目的的引物序列如下:①NEAT1:正向5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′,反向5′-GCACAACACAATGACACCCT-3′;②内参GAPDH:正向5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3′,反向5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′;③miR-34a-5p:正向5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAACCAG-3′,反向5′-TGCGCTGGCAGTGTCTTAGCT-3′;④内参U6:正向5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′,反向5′-AAATATGGAACGCTTCACGA-3′。使用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.4 细胞转染

取处于对数生长期生长状态良好的HeLa细胞,以5×103个/孔接种于细胞培养96孔板,37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜;转染前2 h,换成无血清MEM培养基;用10 μl无血清opti-MEM稀释0.5 μl siRNA(20 μmol/L),并用枪头轻轻混匀,室温下静置5 min;使用前轻轻混匀LipofectamineTM2000,然后取0.25 μl的LipofectamineTM2000稀释在10 μl opti-MEM中,室温下静置5 min;混合LipofectamineTM2000和siRNA的稀释液(总体积为20 μl),轻轻混匀并在室温下静置20 min;每个培养孔分别加混合液20 μl,前后轻轻摇动细胞培养板使混合液与培养板中培养液混匀,细胞于37 ℃、5% CO2培养箱中培养;5 h后吸出混合液换入正常培养基,37 ℃、5% CO2培养箱中培养。设计3条siRNA-NEAT1序列(siRNA-NEAT1-366,siRNA-NEAT1-3312,siRNA-NEAT1-2352),然后转染到HeLa细胞中,同时设未转染组(正常组)和阴性对照组(NC组),利用实时荧光定量PCR筛选出干扰效率最好的1条siRNA,用于后续实验。siRNA-NEAT1-366引物序列:正向5′-GGAGGAGUCAGGAGGAAUATT-3′,反向5′-UAUUCCUCCUGACUCCUCCTT-3′;siRNA-NEAT1-3312引物序列:正向5′-GCGUCUAUUGAAUUGGUAATT-3′,反向5′-UUACCAAUUCAAUAGACGCTT-3′;siRNA-NEAT1-2352引物序列:正向5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAATT-3′,反向5′-UUUCUAAGCAACUUCUCACTT-3′。

1.5 CCK-8法检测细胞活力

取处于对数生长期,生长状态良好的HeLa细胞,以5×103个/孔接种于细胞培养96孔板,在细胞孔周围孔内加入100 μl无菌PBS;37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜。将细胞分为阴性对照组(siRNA-NC组,转染非特异性序列)和siRNA-NEAT1-3312组(转染siRNA-NEAT1-3312序列),37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。然后向每孔加入10 μl CCK-8,37 ℃培养2 h;酶标仪OD450测定各孔吸光值,计算细胞增殖率(%)=(OD实验组-OD空白孔)/(OD空白对照组-OD空白孔)×100%。

1.6 Transwell法检测细胞迁移与侵袭能力

HeLa细胞处理和分组同1.5。胰酶分别消化收集细胞,1 000 r/min,5 min离心,去上清,PBS润洗一次,清洗掉残余血清;无血清MEM培养基重悬细胞,细胞计数板计数,无血清MEM培养基稀释细胞浓度至3×105个/ml,备用。细胞迁移:在24孔板中预先加入700 μl含10%胎牛血清的MEM培养基(含双抗),并放入Transwell小室,在Transwell上室分别接入200 μl各组细胞悬液,37 ℃,5% CO2培养箱培养24 h;取出Transwell,用PBS小心清洗小室一遍,用70%冰乙醇溶液固定细胞1 h;用0.5%结晶紫染液染色,室温中放置20 min,PBS清洗一下,用干净的棉球将上室一侧未迁移的细胞擦干净,显微镜下观察拍照;在3个标准视野下对迁移细胞进行计数。

细胞侵袭:将Matrigel在4 ℃提前一天融化,Transwell小室、24孔培养板和枪头在-20 ℃过夜预冷;用的无血清培养基稀释Matrigel至终浓度1 mg/ml,冰上操作;在24孔板中加入4 ℃预冷800 μl含10%胎牛血清的MEM培养基(含双抗),并放入Transwell小室,在Transwell小室上室底部中央垂直加入100 μl终浓度为0.5 mg/ml的Matrigel,37 ℃温育使其干成胶状,待Matrigel干成胶状后在Transwell上室分别接入200 μl各组细胞悬液,37 ℃,5% CO2培养箱培养;细胞固定染色及计数同细胞迁移。

1.7 划痕实验

HeLa细胞处理和分组同1.5。胰酶消化收集细胞;用marker笔在6孔板背后,用直尺比着,均匀地划横线,横穿过孔;以1×106个/孔接种于细胞培养6孔板,37 ℃、5% CO2饱和湿度条件培养过夜;待细胞密度达到90%以上,铺满6孔板底部,用枪头比着直尺,垂至于背后的横线划痕;用PBS洗细胞3次,去除划下的细胞,加入无血清培养基,同时拍取0 h照片;放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养,在24 h拍照;计算细胞迁移距离(像素)=0 h划痕距离-24 h划痕距离,取平均值。

1.8 流式检测细胞凋亡

HeLa细胞处理和分组同1.5。胰酶消化收集细胞,用PBS将细胞润洗2次,1 200 r/min,5 min离心;按照Annexin Ⅴ-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒操作说明进行:加入500 μl Binding Buffer,重悬细胞;加入5 μl Annexin Ⅴ-APC混匀后加入5 μl 7-AAD,混匀;室温避光反应5～15 min(同时设阴性对照,即正常细胞不加Annexin Ⅴ-APC和7-AAD);流式细胞仪上机检测。

1.9 双荧光素酶报告基因检测试验

取处于对数生长期生长状态良好的293T细胞,以1×105个/孔接种于细胞培养12孔板,37 ℃培养过夜。在293T细胞中进行双荧光素酶报告基因测定,检测NETA1是否与miR-34a-5p相互作用,通过生物信息学分析预测NEAT1与miR-34a-5p基因之间的相互作用位点,采用基因合成技术直接合成NEAT1基因包含靶位点区域的3′UTR片段,并克隆至pYr-miRTarget载体,同时进行定点突变,分别构建野生型和突变型双荧光素酶质粒。将重组质粒(野生型NEAT1-WT和突变型NETA1-MUT)分别与miR-34a-5p模拟物或miR-NC共转染293T细胞。转染48 h后,使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性,比较不同样品间目的报告基因的激活程度。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 NEAT1、miR-34a-5p在HeLa细胞中的表达情况

PCR检测结果显示,与EEC细胞相比,HeLa细胞中NEAT1的mRNA表达增强,miR-34a-5p的mRNA表达降低,差异具有统计学意义(均P<0.05,见图1)。

与EEC细胞相比,*P<0.05

2.2 siRNA-NEAT1干扰序列筛选

本研究设计3条siRNA序列,实时荧光定量PCR结果显示,siRNA-NEAT1-3312组NEAT1的表达最低,即siRNA-NEAT1-3312的干扰效果最佳(见图2),将之用于后续实验中。

与正常组相比,*P<0.05;与NC组相比,#P<0.05;与siRNA-NEAT1-366组相比,&P<0.05;与siRNA-NEAT1-3312组相比,@P<0.05

2.3 敲低NEAT1对HeLa细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响

CCK-8实验检测结果显示,与阴性对照组相比,siRNA-NEAT1-3312转染组细胞增殖率明显降低,差异有统计学意义(P<0.05,见图3)。细胞迁移和侵袭实验结果发现,与阴性对照组相比,siRNA-NEAT1-3312转染组细胞迁移及侵袭数量明显降低,迁移距离明显缩短(均P<0.05,见图4和图5)。凋亡检测结果显示,与阴性对照组相比,siRNA-NEAT1-3312转染组细胞凋亡率明显增高(P<0.05,见图6)。以上结果提示,敲低NEAT1的基因表达可抑制HeLa细胞增殖、迁移及侵袭能力,促进细胞凋亡。

与siRNA-NC组相比,*P<0.05

与siRNA-NC组相比,*P<0.05

图6 siRNA-NEAT1对HeLa细胞凋亡的影响 (n=3)

2.4 NEAT1和miR-34a-5p靶向关系的验证

我们通过ENCORI在线网站(https://starbase.sysu.edu.cn/),将NEAT1的预测靶位点与来自CLIP-seq数据的Ago蛋白结合位点相交来展示miRNA-lncRNA相互作用,使用miRanda程序预测miRNA-lncRNA的相互作用,根据检索策略设置为CLIP Data(low stringency≥1),发现miR-34a-5p可能是NEAT1潜在的结合靶点(见图7)。然后,NEAT1-WT和NETA1-MUT分别与miR-NC、miR-34a-5p模拟物共转染293T细胞,利用双荧光素酶报告基因试验进一步验证了NEAT1与miR-34a-5p的靶向关系。与NEAT1-WT+miR-NC组相比,NEAT1-WT+miR-34a-5p mimics组荧光素酶表达降低(P<0.05);而与NEAT1-MUT+miR-NC组相比,NEAT1-MUT+miR-34a-5p mimics组荧光素酶表达不变(P>0.05,见图8),提示NEAT1靶向miR-34a-5p参与调控HeLa细胞功能。

RL:海肾荧光素酶;FL:萤火虫荧光素酶;WT:野生型;MUT:突变型

3 讨论

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,也是导致女性肿瘤死亡的主要原因之一,尽管治疗和筛查取得了很大进展,但大多数宫颈癌患者确诊时已处于晚期,且治疗耐药性和高复发率使患者预后不佳,因此,寻找新的宫颈癌生物标志物以改善治疗至关重要。近年来,lncRNA的生物学功能得到了广泛的研究,人类基因组测序结果表明只有不到2%的基因组是蛋白质编码基因,其余基因组则转录为非编码RNA,lncRNA是一类长度大于200nt的非编码RNA,其通过与蛋白质、RNA和DNA的相互作用,在转录、翻译和翻译后水平上发挥多种功能,参与表观遗传调控以及转录和转录后修饰,并且是许多病理和生理过程中的关键调控因子[11]。lncRNA不仅广泛参与机体的正常生长发育,而且与人类疾病的发生和发展密切相关。lncRNA的异常表达被认为是癌症发生的关键因素,并且越来越多研究表明lncRNA表达失调与宫颈癌密切相关,lncRNA不仅参与了宫颈癌的发病机制,还在癌症进展、转移、治疗抵抗、HPV调节等方面发挥重要作用[12,13]。如Gan等[14]研究表明lncRNA AC010883.5表达增强诱导ERK1/2和MEK1/2磷酸化增加并激活MAPK信号通路促进宫颈癌细胞增殖、侵袭、迁移和上皮-间充质转化。Buranjiang等[15]研究表明子宫颈癌组织中miR-331-3p与lncRNA HOTAIR和RCC2呈负相关,lncRNA HOTAIR通过靶向miR-331-3p/RCC2轴促进宫颈癌进展。Gibb等[16]采用长片段基因表达关系序列技术检测16例不同级别的宫颈上皮内瘤病变(CIN)组织样本,分析识别出人类宫颈组织中表达的lncRNA共1 056种,确定了CIN中lncRNA表达水平存在差异,这与宫颈癌前病变以及发展存在密切关系。

lncRNA NEAT1位于染色体11q13.1,又称为NCRNA00084,已被鉴定为人染色体11q13.1上的副核小体稳定性的调节剂。研究表明NEAT1在多种恶性肿瘤中表达异常[6]。Wen等[17]研究表明lncRNA NEAT1上的m6A在调节Pol II ser2磷酸化中起着关键作用,新型复合物CYCLINL1/CDK19/NEAT1-1可能为骨转移性前列腺癌的发病机制和发展提供新的见解。NEAT1在卵巢癌表达高于癌旁组织,且与肿瘤分级、FIGO分期、淋巴结转移等密切相关[18]。在宫颈组织表达量随着宫颈病变程度增加而增高,提示NEAT1参与了从早期炎症到晚期癌变的全过程[19]。本研究结果表明,NEAT1在宫颈癌HeLa细胞中的表达明显强于对照细胞,提示了NEAT1在宫颈癌中的重要作用,与在宫颈癌组织和细胞系中的其他研究结果一致[20]。为了进一步研究NEAT1对宫颈癌发病机制的影响,本研究筛选了合适的siRNA敲低NEAT1的表达,发现可以明显抑制HeLa细胞增殖、迁移及侵袭能力,并促进细胞凋亡,提示在宫颈癌中呈现高表达的NEAT1可以促进癌细胞存活,并增强其转移和侵袭能力,从而促进宫颈癌的发生发展。miRNA是广泛存在于真核生物体内的一类长度约为22nt的ncRNA,主要通过抑制翻译或促进细胞质中的mRNA降解来控制转录后的基因表达[21]。lncRNA可充当miRNA的竞争内源性RNA,并参与一系列细胞途径[11]。本研究结果同时发现在HeLa细胞中,miR-34a-5p的mRNA表达降低,与在宫颈癌组织中检测到的结果一致[21]。而我们通过生物信息学分析显示miR-34a是NEAT1的靶基因,故推测NEAT1可能通过参与调控miR-34a表达参与宫颈癌变过程。最后我们利用双荧光素酶报告基因试验进一步验证了NEAT1与miR-34a-5p的关系,提示NEAT1通过miR-34a-5p调控宫颈癌细胞增殖、凋亡、侵袭和转移。

总之,在本研究中,我们发现NEAT1在宫颈癌细胞中高表达,体外实验证实NEAT1靶向miR-34a-5p参与调控宫颈癌细胞的增殖、凋亡、转移和侵袭,为将NEAT1作为治疗宫颈癌的潜在分子提供理论依据。然而该研究存在局限性,包括未进行可靠的临床特征分析、未进行动物实验以及对调节机制的研究不足,这些限制可能导致本结果的局限性,在后续研究中,我们将挖掘调节机制,进一步开展临床分析和动物实验以验证本研究结果。