银屑病皮损间充质干细胞来源外泌体对PBMCs分泌细胞因子的影响

王思宇,牛旭平

(1山西医科大学第九临床医学院皮肤科教研室,太原 030001;2太原市中心医院皮肤科;*通讯作者,E-mail:nnxxpp1978@sina.com)

银屑病是一种复杂的炎症性免疫性疾病[1],目前研究发现银屑病与Th1/Th2、Th17/Treg细胞失衡、分泌的细胞因子IL-23、IL-17、IL-10、TGF-β1紊乱有关[2,3],但其发生发展机制并不完全清楚。研究认为银屑病皮损处细胞参与局部免疫机制[4,5],并相互作用。外泌体通过“内吞”途径在细胞内形成,携带蛋白质等关键生物信号参与各类病理生理过程[6,7]。间充质干细胞通过外泌体传递生物信号,释放细胞产物,参与各种生物信号通路的活化或抑制[8,9]。银屑病皮损及健康人皮肤间充质干细胞(dermal mesenchymal stem cells, DMSCs)是否通过外泌体来参与银屑病炎症因子的代谢尚不明确。本研究通过提取健康人及银屑病DMSCs来源的外泌体(DMSC-derived exosomes, DMSCs-EXO),作用于健康人及银屑病患者外周血单个核细胞,分析DMSCs-EXO对外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)分泌银屑病相关因子的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

DMEM/F12培养基来自美国HyClone公司,Ultra-CULTURE无血清培养基来自美国LONZA公司,植物凝集素(PHA)来自北京Solarbio公司,人IL-17、TGF-β1、IL-23、IL-10 ELISA检测试剂盒来自上海西唐生物科技有限公司,Optima XE超速离心机来自美国Beckman公司,透射电镜来自日本电子株式会社。

1.2 实验细胞

DMSCs来源于太原市中心医院皮肤科门诊的寻常型银屑病患者及泌尿外科行包皮环切术后留存的正常包皮皮肤组织,PBMCs来源于太原市中心医院门诊诊断的寻常型银屑病患者外周血及健康志愿者外周血。该研究已通过太原市中心医院伦理委员会批准(批准号2022011)。所有健康志愿者均除外银屑病。所有研究对象已排除其他免疫疾病及炎症性疾病,取材前3个月内未使用糖皮质激素、生物制剂及免疫抑制剂等治疗。

1.3 皮肤来源间充质干细胞的分离与培养

将皮肤组织清洗干净,冲净残血,除去角质及多余皮下结缔组织,清洗后将组织剪碎,加入0.025%中性蛋白酶(Dispase)浸没组织过夜,将组织真表皮分离。收集真皮,使其充分破碎。筛网过滤后滤液以800 r/min离心8 min,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞,进行培养。当传至第2代的DMSCs细胞长至铺满培养瓶底部约70%时,直接倾倒掉原培养基,更换无血清培养基继续培养约24 h待细胞长至90%左右时,收集上清液进行ELISA法检测IL-23、IL-17、IL-10和TGF-β1细胞因子水平。

1.4 差速超速离心法提取纯化外泌体

将样本配平后分别以300g,2 000g及10 000g离心,收集上清液,使用0.22 μm滤膜过滤,将滤液在超速离心机中,120 000g超速离心70 min。去除上清后PBS重悬,再次120 000g超速离心70 min。去除上清,用PBS收集沉淀的外泌体[10,11]。

1.5 透射电镜分析

吸取10 μl外泌体悬液滴加在电镜专用铜网上,添加10 μl醋酸双氧铀在铜网上染色,待样本干燥后立即使用80～100 V电镜对所提样品进行成像检测,鉴定其是否符合外泌体标准。

1.6 PBMCs分离

使用EDTA抗凝管采集3例银屑病患者及3例健康人外周血各10 ml,采用Ficoll-Hypaque梯度分离法分离PBMCs。使用含有植物凝集素PHA 50 μg/ml的RPMI1640培养基重悬细胞。

1.7 分组及处理

实验分4组,具体如下:在健康人来源的PBMCs(healthy PBMCs,HP)中分别添加银屑病患者皮损处的间充质干细胞分泌来源的外泌体(psoriasis DMSC-derived exosomes,PDMSCs-EXO)及健康人皮肤组织间充质干细胞来源的外泌体(healthy DMSC-derived exosomes,HDMSCs-EXO);在银屑病人来源的PBMCs(psoriasis PBMCs,PP)中分别添加PDMSCs-EXO及HDMSCs-EXO。将状态良好的PBMCs按照2×106个/孔分组,于0 h(初始对照)收取上清液后,分别添加100 μl/孔不同来源的DMSCs-EXO,放置于37 ℃恒温箱培养,并分别于培养24 h及72 h时收集上清液,保存于-20 ℃冰箱,随后进行ELISA检测。

1.8 ELISA法检测细胞上清液中细胞因子

按照说明书操作检测分组培养后细胞上清液中IL-23、IL-17、IL-10和TGF-β1细胞因子水平。将试剂盒中10×标本稀释液及20×浓缩洗涤液用双蒸水稀释,将标准品按照各自说明书配制标准品梯度。检测TGF-β1样本按照1∶2进行稀释,余样本不稀释。每孔各加入标准品或待测样品,置于37 ℃恒温摇床反应40 min。用配好的洗涤液将反应板充分冲洗4～5次后,滤纸吸干。分别加入试剂盒中的IL-23、IL-17、IL-10、TGF-β1第一抗体工作液,将反应板置于37 ℃温箱20 min。再次洗板后每孔加入试剂盒中的酶标抗体工作液,将反应板放置于37 ℃温箱10 min。再次洗板后每孔加入底物工作液,放置于37 ℃温箱避光15 min。随后加入终止液并震荡混匀,立即使用全自动酶标仪检测OD450处的吸光值。绘制标准曲线后计算相应浓度。IL-17、TGF-β1、IL-23和IL-10灵敏度分别为3 pg/ml,15 pg/ml,4 pg/ml,1 pg/ml。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 DMSCs形态学观察

正常人及银屑病DMSCs在显微镜下观察细胞形态,可见呈典型的长梭形样外观,大小不一,贴壁生长(见图1)。

2.2 外泌体形态学观察

透射电子显微镜的观察结果显示,外泌体呈杯托状,椭圆形,可见明显的脂质双分子层膜结构,符合外泌体特征,单个或聚集分布(见图2),结果提示外泌体提取质量较好。

放大倍数×150 000 放大倍数×100 000

2.3 细胞培养物中细胞分泌相关因子含量

ELISA检测PBMCs被不同来源EXOs干预前后的分泌相关因子变化,结果见表1～4。HP+PDMSCs-EXO组干预24 h及72 h时IL-17及IL-23浓度相较初始对照(0 h)上调(P<0.05),24 h时IL-10及TGF-β1浓度相较初始对照时间下调(P<0.05)。PP+HDMSCs-EXO组24 h及72 h时IL-17及IL-23浓度相较初始对照时间下调(P<0.05),24 h时IL-10及TGF-β1浓度相较初始对照时间上调(P<0.05)。在24 h及72 h时,HP+PDMSCS-EXO组IL-23、IL-17高于HP+HDMSCS-EXO组(P<0.05),IL-10、TGF-β1低于HP+HDMSCS-EXO组(P<0.05);在24 h及72 h时,PP+HDMSCs-EXO组IL-23、IL-17低于PP+PDMSCS-EXO组(P<0.05),IL-10高于PP+PDMSCS-EXO组(P<0.05),24 h时,TGF-β1高于PP+PDMSCS-EXO组(P<0.05)。相较于HP+HDMSCS-EXO组,在72 h时,PP+HDMSCS-EXO组IL-23、IL-17值无明显差异;相较于HP+PDMSCS-EXO组,在24 h,PP+PDMSCS-EXO组IL-23、IL-17及TGF-β1无明显差异,在72 h时TGF-β1无明显差异。

表1 不同来源的EXO干预后银屑病患者及健康人PBMC中IL-23的变化

表2 不同来源的EXO干预后银屑病患者及健康人PBMC中IL-17的变化

表3 不同来源的EXO干预后银屑病患者及健康人PBMC中TGF-β1的变化

表4 不同来源的EXO干预后银屑病患者及健康人PBMC中IL-10的变化

3 讨论

银屑病是一种复杂的炎症性免疫性疾病,研究发现银屑病与相关炎症细胞失衡、分泌的细胞因子紊乱有关,但发生发展机制并不完全清楚[12]。已有研究显示,间充质干细胞对银屑病有一定程度治疗作用[13]。皮肤组织间充质干细胞来源的外泌体携带相关生物功能信息,应有与间充质干细胞类似作用,而银屑病皮损间充质干细胞来源的外泌体是否携带银屑病相关促炎物质,是否对PBMC有促炎转化作用尚未有定论。

本研究使用差速超速离心法提取间充质干细胞外泌体,所提外泌体优质且浓度较高。统计结果表明,健康人皮肤间充质干细胞外泌体抑制了银屑病患者PBMCs中IL-17、IL-23,并加强了IL-10、TGF-β1表达,促进了健康人PBMCs中TGF-β1的分泌且抑制了IL-17的分泌;同时,结果显示与健康人皮肤间充质干细胞来源外泌体相比,银屑病皮损间充质干细胞外泌体可促进健康人外周血单个核细胞分泌IL-17、IL-23细胞因子,并减少IL-10、TGF-β1的分泌,对银屑病患者PBMCs有继续增强IL-17分泌的作用。本研究结果表明,银屑病皮肤间充质干细胞通过外泌体参与PBMCs分泌细胞因子的调节,这种调节作用部分是具有放大性及选择性的。刘佳等[14]研究表明,这种调节作用可能与间充质干细胞外泌体中携带的miR-155有关。由此推测,在银屑病皮损发生处,已有的皮损可能会通过外泌体促进皮损周围正常皮肤向银屑病皮损转化,减弱皮损周围正常皮肤的抵抗作用,从而加速银屑病皮损的增殖与扩大。而在银屑病皮损接受健康间充质干细胞的外泌体弱化炎症通路时,会纠正银屑病的炎症发生。

综上所述,银屑病间充质干细胞可通过外泌体参与炎症信号的传递,可能为银屑病的治疗提供新的靶点。