艾灸预处理对急性胃黏膜损伤大鼠NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路的影响

阿斯卡尔·牙生,霍新慧,阿力米热·阿布都热西提,张恒雷,马雨欣,张莉萍

(新疆医科大学,新疆 乌鲁木齐 830001)

现代医学认为,急性胃黏膜损伤指机体在损伤、应激与化学刺激等状态下,以浅表胃黏膜受损为主的病理学改变和胃黏膜发生糜烂、浅溃疡和出血为特征的急性胃黏膜出血性病变[1]。在消化系统疾病中,属于常见的、频发的致病因素之一。在胃黏膜防御能力弱和理化刺激、细菌等侵袭因子致病力强两种因素的共同作用下导致胃黏膜损伤的发生。已有相关研究[2]说明,针灸对于胃黏膜损伤保护有较好的效果。胃黏膜损伤不仅发生机制较为复杂,而且其修复也是十分复杂的过程。有相关研究[3]发现,导致胃黏膜损伤反复并影响其恢复的最主要因素是炎症反应。因此,抑制炎症反应至关重要。细胞焦亡是由Gasdermin介导的一种程序性细胞死亡,其特征是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase-1)依赖性激活和大量促炎细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)的释放,在细胞外环境中诱导促炎反应[4]。

艾灸利用艾叶辛温的特性,外加艾火之热能效应于受术部位(局部、腧穴),有温经通络、均衡阴阳的功效,能够达到预防病症的发生、发展与强身健体的“治未病”目的[5],是中医“治未病”的重要手段。研究显示,艾灸通过调节信号通路等,达到抗炎的治疗作用[6]。此外,艾灸预处理作为一种重要的干预手段,在“未病先防,已病防变”中有其独特优势,也有研究[7]指出艾灸预处理能够降低大鼠胃黏膜损伤,激发其抗胃黏膜损伤的能力。本研究主要探究艾灸预处理对急性胃黏膜损伤大鼠NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)/含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase-1)/消皮素D(Gasdermin D,GSDMD)通路的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物

由新疆医科大学动物实验中心提供雌雄各半SD大鼠30只,体质量为(200±20)g,动物许可证号:SYXK(新)2018-0003,委托新疆医科大学动物实验中心饲养。饲养环境:温度18～25 ℃,相对湿度40%～70%,自然明暗周期,适应性饲养1周后进行实验,实验过程中操作及处置均符合动物伦理学标准。

1.2 试剂及仪器

1.2.1 仪器 分析天平(德国,赛多利斯 BL310/BL21S);移液器(美国,康宁 4070 4073 4075);凝胶成像分析系统(台湾,威泰克有限公司 KETA M 多用凝胶成像系统);大鼠手术台(安迪教学实验仪器,规格300 mm×210 mm×35 mm);一次性针灸针(华佗牌,规格0.25 mm×13 mm);分光光度计(日本,岛津UV-2540);蛋白印迹仪(台湾,威泰克有限公司 Yrdimes SW07D0567);艾灸条(南阳汉医艾绒有限责任公司,规格4 mm×120 mm);固定支架(知福堂,蕲春上工记艾灸器具开发有限公司);酶标分析仪(Infinite F50,上海优选生物科技有限公司);基础电泳仪电源(威泰克有限公司 ELITE 300PLUS E5W0541);高速冷冻离心机(德国,艾本德 5415C);台式恒温振荡器(中国,上海精宏实验设备有限公司 THZ-312)。

1.2.2 试剂 无水乙醇(天津致远化学试剂有限公司);阿司匹林肠溶片(拜耳医药保健有限公司,规格100 mg×30片/盒);大鼠TNF-α ELISA试剂盒(上海优选生物科技有限公司,批号:YX-E21174,批次:202205);大鼠1L-1β ELISA试剂盒(上海优选生物科技有限公司,批号:YX-E20958,批次:202205);大鼠1L-18 ELISA试剂盒(上海优选生物科技有限公司,批号:YX-E21189,批次:202210)

2 实验方法

2.1 分组及处理

随机分为正常组、模型组和艾灸预处理组共3组,每组10只,雌雄各半。在常规喂养7 d后,每日上午10点开始艾灸预处理操作。大鼠腧穴选取根据实验大鼠常用穴位定位法[8]进行确定。中脘穴位于前正中线脐上约20 mm;足三里穴位于膝关节后外侧,腓骨小头下约3 mm处。

2.2 干预方法

2.2.1 正常组 正常抓取后自然束缚固定在大鼠手术台,不施灸法,每天持续20 min,1次/d,连续7 d。

2.2.2 模型组 正常抓取后自然束缚固定在大鼠手术台,不施灸法,每天持续20 min,1次/d,连续7 d。

2.2.3 艾灸预处理组 正常抓取后自然束缚固定在大鼠手术台,予以艾灸预处理。选取足三里(双)和中脘穴,采用温和灸,使艾条点燃部位垂直距离大鼠穴位约2 cm,艾灸处局部温度控制在42 ℃左右(使用温度测定仪控温)。每天持续艾灸20 min,1次/d,连续施艾灸7 d。

2.3 模型制备

在预处理第7天结束之后,第8天禁食不禁水,第9天开始对模型组、艾灸预处理组进行急性胃黏膜损伤模型的制备。采用无水乙醇与阿司匹林混悬液法常规灌胃建立模型,先用无水乙醇0.6 mL/100 g进行灌胃,1 h后再予以(200 mg/kg)阿司匹林混悬液0.1 mL/100 g进行灌胃造模,造模操作持续7 d。

2.4 取材

造模结束后,当天22点禁食禁水,第2天上午10点开始取材。腹腔麻醉(10%水合氯醛,0.3 mL/100 g),起效后,腹主动脉取血,使用离心机离心后取上层血清;解剖将全胃取出,沿胃大弯剪开,迅速用生理盐水冲洗干净,充分暴露胃黏膜组织,用于UI评估。

2.5 指标检测

2.5.1 胃黏膜损伤指数(UI) 所有大鼠摘下全胃并剖开,用生理盐水冲洗后平摊在编码滤纸上,肉眼观察,按照GUTH法评估UI,全胃各病灶的长度根据GUTH标准评分后加和为损伤指数。

2.5.2 HE染色 将完成UI评估的大鼠全胃分为两份,每一份均含胃底、胃体和胃窦3部分。取1份进行常规脱蜡、洗染、脱水处理、透明与封固等操作,在光镜下直接观察胃黏膜组织的炎性浸润状况。对胃组织炎症损害程度进行全面病理学评价。通过在光镜下观察、测量胃黏膜损害的深浅程度和损害所占胃黏膜的面积,对比3组大鼠胃粘膜损伤程度的不同。光镜下胃黏膜损伤指数=损伤深度评分×损伤面积评分。见表1。

表1 胃粘膜炎症浸润损伤评分标准

2.5.3 ELISA法检测各组大鼠胃粘膜组织中IL-1β、IL-18及TNF-α的表达情况 收集各组细胞上清液,4 ℃下低速离心后,并置于-80 ℃以下保存。根据试剂盒说明书的试验方法计算OD值,并计算白细胞介素IL-1β、IL-18及TNF-α的样本浓度。

2.5.4 Western blot检测胃黏膜组织NLRP3、Caspase-1和GSDMD蛋白表达 提取大鼠胃组织总蛋白,在离心机中离心5 min,取上清液用BCA法测定蛋白浓度;将蛋白溶液按照4∶1的比例加入缓冲液中,通过沸水浴加热使其变性,经过电泳分离、PVDF转膜、封闭和稀释,室温孵育操作后,ECL法显色;使用AlphaEase FC软件分析条带灰度值,以目的蛋白灰度值/内参β-actin灰度值比值作为最终结果[9]。

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 各组大鼠一般情况比较

正常组实验大鼠皮毛平滑,毛色白,自由饮食饮水,活动敏捷,较为活泼,体质量呈增长趋势;与正常组大鼠相比,模型组大鼠皮毛粗糙发黄,饮食饮水量减少,活动显著迟缓,体质量显著减轻;灸预处理组大鼠在皮毛颜色、活动情况、饮食饮水和体质量方面与模型组相比,均有显著性改善,体质量总体也呈上升趋势。体质量对比见表2。

表2 各组大鼠体质量比较

3.2 各组大鼠胃黏膜损伤指数(UI)比较

与正常组比较,模型组和艾灸预处理组胃黏膜UI显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01),表明造模有效。与模型组比较,艾灸预处理组大鼠胃黏膜UI显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01),胃粘膜损伤明显减轻。见表3。

表3 各组大鼠胃粘膜损伤指数(UI)比较

3.3 各组大鼠胃组织炎症损伤病理观察比较

HE染色后通过镜下观察3组大鼠胃黏膜组织形态:正常组胃黏膜组织构造完好,表层平滑,黏膜皱襞整齐且厚薄适中,细胞排列整齐、无剥落或缺损;模型组大鼠胃黏膜组织发生显著的损伤,胃黏膜增厚呈现无明显界限的变薄皱缩,腺体结构和排列混乱;灸预处理组大鼠胃黏膜有一定程度的损伤,但损伤比模型组轻。见图1。

图1 各组大鼠胃组织炎症损伤病理观察(HE染色,400×)

3.4 ELISA法检测大鼠血清中IL-1β、IL-18与TNF-α含量

与正常组比较,模型组所测出的IL-1β、IL-18和TNF-α 3种细胞因子含量均明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01);艾灸预处理组IL-1β、IL-18和TNF-α含量与正常组比较均有明显提高,与模型组比较显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。见表4。

表4 各种大鼠血清IL-1β、IL-18和TNF-α含量比较

3.5 Western blot检测大鼠胃黏膜组织NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表达

与正常组比较,模型组细胞内焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase-1及GSDMD的表达上调,差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,艾灸预处理组大鼠胃组织NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表达水平显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。见图2～4。

注:A.正常组;B.模型组;C.艾灸预处理组。与正常组比较,**P<0.01;与模型组比较,△P<0.05。图2 Western blot法检测各组胃黏膜损伤大鼠胃黏膜NLRP3蛋白表达量(n=10)

注:A.正常组;B.模型组;C.艾灸预处理组。与正常组比较,**P<0.01;与模型组比较,△△P<0.01。图3 Western blot法检测各组胃黏膜损伤大鼠胃黏膜Caspase-1蛋白表达量(n=10)

注:A.正常组;B.模型组;C.艾灸预处理组。与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,△P<0.05。图4 Western blot法检测各组胃黏膜损伤大鼠胃黏膜GSDMD蛋白表达量(n=10)

4 讨论

胃黏膜损害主要是由其防卫机制相对降低和破坏因子功能相对提高引起,在机体遭受内外环境损伤因素的影响下,直接导致幽门螺旋杆菌、胃酸、胃蛋白酶和胃黏膜损害因子的释放增加,降低了胃黏膜屏障防卫机制,胃黏膜引起损伤[2]。

细胞焦亡又称细胞炎性坏死,大量研究发现并且证实了其经典通路的作用是通过炎性半胱天冬酶中的Caspase-1,并伴有大量促炎症因子的释放。Caspase-1通路通过炎症小体感知危险,招募并活化Caspase-1,Caspase-1切割IL-1β 原蛋白和IL-18原蛋白,激活IL-18、IL-1β等炎症因子[10],切割GSDMD的N端序列,使其结合到膜上产生膜孔,导致细胞焦亡。深入研究由Caspase-1介导的细胞焦亡经典通路,将有助于理解其在胃黏膜损伤发展中的作用,进一步揭示艾灸治疗胃黏膜损伤的机制,完善艾灸治疗急性胃黏膜损伤的治疗方法。

随着现代医学的发展,药物治疗在一定程度上能够控制胃黏膜损伤的症状,但同时服用药物又能引发肝肾等不良反应,进一步加剧胃的负担,因此探究预防胃溃疡的方法已刻不容缓。《备急千金要方》记载:“若要安,三里常不干”,就提到了在足三里进行化脓灸的预防保健作用,为后世“灸法治未病”奠定了理论基础。前期有研究发现,针灸预处理对急性胃黏膜损伤有预防保护作用[11-12],可有效缓解胃部的炎症反应,并能促进急性胃黏膜损伤中受损组织的恢复。艾灸预处理又叫“逆灸”,首见于《范东阳杂病方》,在《针灸聚英》也有记载。在现代研究中发现[13-14],艾灸预处理通过激发人体的免疫机制,增强人体的疾病预防能力,也能在机体受到外界刺激时,很大程度上降低因此受到的伤害,其作用可以广泛应用到神经、消化、肌肉、呼吸与心血管等治疗中。本研究灸预处理选取足三里、中脘穴二穴。足三里是胃经的合穴、胃的下合穴,是民间广为流传的“强身健体要穴”,《四总穴歌》中写到“肚腹三里留”,记载了足三里在脾胃疾病中的治疗作用,在《针灸大成》中运用该穴治疗脾胃疾病频率高达30%[15]。现代研究也证实了足三里具有抗炎、细胞保护、修复胃黏膜与增强机体免疫力的作用[16-17]。中脘穴为胃之募穴,八会穴之腑会,有健脾和胃、治疗胃痛的作用。足三里、中脘穴合募配穴治疗胃腑疾病疗效确切[18]。

IL-1β和IL-18由NLRP3激活后介导产生,是一种常见的炎症因子,在炎症反应中起到核心作用。当IL-1β和IL-18表达水平升高时,会促进炎症反应的进一步发生。肿瘤坏死因子α(TNF-α)是一种常见且重要的炎性介质,适量的TNF-α具有激活免疫系统、促进白细胞介素分泌的作用[19-20],但其过量表达时,则会与其他炎性介质共同作用引起不同的病理损伤。与正常组相比,模型组大鼠血清中IL-1β、IL-18和TNF-α含量显著提高,提示了胃黏膜炎症的发生;艾灸预处理组的大鼠血清中IL-1β、IL-18和TNF-α含量相较于模型组可见明显降低,说明艾灸预处理能通过减少大鼠血清中IL-1β、IL-18和TNF-α的表达,抑制炎性介质产生,参与到胃黏膜保护的机制中。

本实验结果显示,与正常组比较,模型组NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表达水平上升(P<0.01),且IL-1β蛋白的表达水平显著升高(P<0.01),说明在外界因素信号的刺激后,Caspase-1被激活后切割pro-IL-1β、pro-IL-18,释放出有活性的炎性因子IL-1β,使得更多的炎性细胞聚集,加重了胃黏膜局部的炎症反应。与模型组比较,艾灸预处理组大鼠胃组织NLRP3、Caspase-1、GSDMD及IL-1β蛋白的表达水平显著降低(P<0.01),证实艾灸预处理可能是通过抑制NLRP3蛋白的表达,减少了NLRP3炎症小体的合成,进一步抑制了细胞死亡经典通路相关标志分子的表达以及白细胞介素-1β等促炎因子的释放,抑制了炎症反应的发生,从而减轻急性胃粘膜损伤大鼠黏膜损伤,达到了保护胃黏膜的作用。

综上所述,通过艾灸预处理足三里、中脘穴能够有效地起到对细胞焦亡NLRP3、Caspase-1及GSDMD这一经典通路的抑制作用,提高机体抗氧化能力及促进胃黏膜保护因子的产生途径发挥其缓解胃黏膜损伤的作用,降低炎症反应的发生,对于防治急性胃黏膜损伤具有可观的疗效,也为临床应用提供理论支持,同时推动“灸法治未病”体系的完善。但灸法激发胃黏膜的保护作用是多方面的,本课题组将对其作用机制作进一步深入研究。