基于网络药理学的党参替代人参治疗溃疡性结肠炎的可行性研究

2023-11-23刘东张莉许金凤万彦吴娇娇夏佳杨雨敖慧

成都中医药大学学报 2023年5期

刘东，张莉，许金凤，万彦，吴娇娇，夏佳，杨雨，敖慧

(成都中医药大学药学院，四川成都 611137 )

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种由遗传背景与环境因素相互作用而导致的慢性炎症性疾病，表现为结直肠黏膜的持续性炎症反应，病变呈连续性，临床以反复发作和缓解交替为特点。近年来，我国溃疡性结肠炎的发病率和患病率呈快速上升趋势，已成为临床常见病[1]。根据UC临床特点，中医上多将之归属于“久痢”“肠澼”“泄泻”“便血”等，本病以“本虚标实”为特点，脾虚为导致UC的主要因素之一，《诸病源候论》记载：“虚损不复，遂连滞涉引岁月，则为久痢也。”此期辨证多为虚实夹杂，以虚为主，健脾补肾兼除湿导滞为其治疗大法，“四季脾旺不受邪”，说明健脾为其正治，临床多选用参苓白术丸、补中益气汤、附子理中丸等加减治疗[2]。白术(BZ)常配伍人参(RS)治疗UC[3]。但在临床实践中党参(DS)代替人参配伍白术在治疗脾虚型溃疡性结肠炎中使用频率亦较高。但党参是否能代替人参与白术配伍治疗UC尚无定论。

网络药理学利用组学、网络分析和数据处理等技术，通过“药物-成分-靶点-疾病”之间多层次、多角度的生物网络关系，预测药物可能的作用机制，适合中医复方研究。本文首次通过网络药理学方法对人参和党参配伍白术在治疗溃疡性结肠炎的药效物质基础和作用机制进行对比研究，旨在探讨其物质基础和作用机制异同，为临床使用党参替代人参治疗溃疡性结肠炎提供参考。

1 方法

1.1 药物成分靶点筛选

通过YaTCM数据库分别筛选人参、党参、白术含有的化合物。YaTCM数据库包含6 220种草药、47 696种天然化合物、18 697种靶标，从中可以获取不包含在TCMSP、ETCM、SYMMAP里的草药的信息。该数据库的复方-草药、草药-成分信息来源于多个方面，包括数据库，如TCMID、TCMSP、TCM@Taiwan，书籍和文本挖掘。OB通过YATCM系统提供算法得到，此算法设定OB大于80为高吸收，小于20为低吸收，以DL≥0.18，OB≥80为条件筛选有效化合物。通过Pubchem数据库查找有效化合物结构，然后用Swisstargetpredition预测靶点，以预测靶点P≥0.1为筛选条件，得到药物潜在靶点数据库。

1.2 疾病靶点筛选

以“ulcerative colitis”为检索词在Gene Cards数据库(https//www.genecards.org/)、Drug Bank数据库(https//www.drugbank.ca/)、Disgenet数据库中(https//www.disgenet.org/)以Score=1为筛选条件查找各个数据库中疾病相关靶点并删除重复项，得到UC靶点数据库。

1.3 药物、疾病交集靶点

将党参与白术潜在靶点数据库合并，去除重复靶点得到党参-白术潜在靶点合集，同法得到人参-白术潜在靶点合集。将上述合集靶点分别与UC靶点通过在线软件 Venny 2.1.0(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)取交集，分别得到人参配伍白术与UC(下文以RS组表示)的交集靶点、党参配伍白术与UC(下文以DS组表示)的交集靶点，绘制韦恩图。并计算两组共有靶点在RS组中的占比，即为党参替代人参的可替代比。

1.4 PPI网络

将1.3得到的交集靶点分别导入STRING平台(https：//string-db.org/)，物种设置为 “Homo sapiens”，置信度设置为0.4，获得靶标的相互作用关系，以TSV格式保存，导入 Cytoscape 3.8.2软件，分别构建RS组和DS组蛋白互作网络图。

1.5 富集分析

将1.4得到的两组交集靶点导入到Metascape(http：//metascape.org/)数据库中，选择Multiple Gene List选项，物种选择“homo sapiens”，点击Costom Analysis进入下一步。在Enrichment页面设置P≤0.05，勾选GO Biological Processes选项进行基因本体论(gene ontology，GO)生物学过程分析；勾选KEGG Passway选项进行京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析。得到GO分析结果和KEGG富集结果。

1.6 通路-靶点-成分-药物网络构建

利用Cytoscape 3.8.2软件对1.5中得到的关键通路分别绘制通路-靶点-成分-药物网络图。

2 结果

2.1 药物活性成分、预测靶点

人参得到92种化合物，主要包括人参皂苷类、甾醇类、有机酸及酯类化合物，去重后得到729个靶点。党参得到51种化合物，主要包括甾醇类、有机酸及酯类、还有部分三萜类化合物，去重后得到461个靶点。白术得到17种化合物，主要是酯类，去重后得到393个靶点。其中人参和党参共有的成分有13种主要包括豆甾醇、灌木远志酮 A、有机酸及其酯类化合物。药物成分见表1，其中*G代表人参和党参共有成分。

表1 药物成分表

2.2 疾病靶点

在Gene Cards数据库得到179个靶点，在Drug Bank数据库得到70个靶点，在Disgenet数据库中符合筛选条件的靶点有380个，合并去重后得到553个疾病相关靶点。

2.3 药物、疾病交集靶点

利用Venny 2.1.0绘制韦恩图，其中RS组的交集靶点有93个(图1A)，DS组的交集靶点有76个(图1B)。比较发现，DS组能够替代RS组的靶点，即共有靶点有70个，其可替代比约为75%。RS组特有靶点23个，DS组特有靶点6个，具体靶点见表2。

注:A为人参-白术与溃疡性结肠炎(即RS组)交集靶点;B为党参-白术与溃疡性结肠炎(即DS组)交集靶点;BZ为白术简称

表2 人参-白术、党参-白术与溃疡性结肠炎交集靶点

2.4 PPI网络

为了进一步研究两组药对治疗UC的作用机制，将RS组的93个交集靶点和DS组的76个交集靶点分别导入STRING数据库进行PPI网络分析，并利用Cytoscape 3.8.2进行可视化处理，节点连接度越大表明其在PPI网络中越重要，连接度越大，节点颜色越深大小越大(图2A，2B)。RS组网络包含92个节点和925条边，DS组网络包含75个节点和607条边。以degree值的中位数进行3次筛选，RS组得到13个靶点，DS组得到10个靶点(见表3)，两组共有靶点包括TNF、AKT1、VEGFA、STAT3、ESR1、CCND1、PPARG、MMP9、PTGS2，这些靶点可能是两组药对治疗溃疡性结肠炎的核心靶点。其中RS组网络特有靶点四个，是IL6、TLR4、TP53、HRAS。而DS组网络只有ERBB2是特有靶点。

注:A为RS组PPI网;B为 DS组PPI网络

表3 RS组和DS组PPI高连接度基因(3倍中位数)

2.5 富集分析结果

由Metascape软件分析得到KEGG和GO富集结果。去除不同表达的同一个KEGG通路,RS组富集得到147条KEGG通路(P<0.05),特有通路12条,包括氧化磷酸化(LogP=-1.8)、溶酶体(LogP=-2.1)、吞噬体(LogP=-1.8)等通路;DS组富集得到136条KEGG通路(P<0.05),特有通路1条为醛固酮的合成与分泌(LogP=-2.6),两组共有通路135条,其可替代比约为92%。将所有KEGG归类,两组前20条通路中有19条相同,这可能是党参替代人参发挥作用的机制,并作heatmap图(图3)。KEGG结果表明两者都主要通过细胞因子-细胞因子受体相互作用通路对UC起作用。

图3 RS组和DS组KEGG heatmap图

RS组富集得到1 515条生物学过程(P<0.05),DS组富集得到1 224条生物学过程(P<0.05),其中两组共有生物学过程1 196条,可替代比约为79%。两组均可将所有BP条目归为23类,发现两组前20条具有代表性的BP条目皆相同,并作heatmap图(图4)。二者主要通过蛋白质磷酸化的正调控、激素水平的调节和对肽的反应等生物学过程对UC发挥治疗作用。

图4 RS组和DS组GO生物学过程heatmap图

A.RS组的细胞因子-细胞因子受体相互作用通路的网络图 B.DS组细胞因子-细胞因子受体相互作用通路的网络图

2.6 通路-靶点-成分-药物网络

利用Cytoscape软件对2.5中得到RS组和DS组的细胞因子-细胞因子受体相互作用绘制通路-靶点-成分-药物网络图(图4)。图4A和4B分别是RS组和DS组的细胞因子-细胞因子受体相互作用通路的网络图,在此通路DS组和RS组中白术的物质基础相同,主要为双白术内酯和白术三醇,党参主要通过甾醇类、黄酮类等化合物发挥作用,人参主要通过人参皂苷等发挥作用。RS组在这条通路上富集到了13个基因,DS组富集到了11个基因,其中有10个基因共同出现,分别是CCR1、FLT3、IL2、KIT、MET、PDGFRB、TGFBR1、TGFBR2、TNF和VEGFA,其可替代比约为77%。

3 讨论

参苓白术散、四君子汤等为治疗脾虚型溃疡性结肠炎的常用方剂，人参、党参和白术都是补脾益气的常用药物。在古籍中参苓白术散、四君子汤等常用人参配伍白术，而现代医家多用党参配伍白术代替人参治疗UC[3]。关于党参代替人参使用的研究目前较少，因此，本文首次采用网络药理学探究党参替代人参配伍白术治疗溃疡性结肠炎的可行性。

UC发病机制与结肠上皮细胞、黏膜屏障和上皮屏障缺陷有关[4，5]。免疫功能异常是导致UC的重要因素，涉及先天性免疫和适应性免疫，包括多种免疫细胞(如抗原呈递细胞、多种T细胞等)和多条信号通路(cytokine-cytokine receptor interaction、NF-κB、MAPK信号通路等)，这些免疫细胞和信号通路的激活产生大量的细胞因子(如炎性因子、免疫因子、趋化因子等)，从而加剧肠道炎症反应[6-8]。

本研究利用网络药理学方法，筛选得到人参、党参、白术三者有效成分、潜在作用靶点，将党参和人参分别与白术配伍，然后与UC作用靶点取交集，分别得到RS组和DS组的交集靶点。两组交集靶点分别做PPI分析和富集分析，对富集得到的核心通路绘制通路-靶点-处方-药物网络图，进而从多方面比较党参能否替代人参发挥治疗作用。

通过对PPI结果分析比较，发现两组药对共有的核心靶点是肿瘤坏死因子(TNF)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、信号转导子和转录激活子3(STAT3)和血管内皮生长因子A(VEGFA)。TNF作为细胞因子家族中的关键促炎因子，与UC的发生、发展、转归有密切关系[9]。TNF可诱导肠屏障抵抗力显著降低，固有层产生的TNF可导致UC特有的屏障缺陷[8]。AKT1是3种密切相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1、AKT2和AKT3)之一，称为AKT激酶，可调节许多过程，包括代谢、增殖、细胞存活、生长和血管生成，AKT是PI3K下游信号通路的关键蛋白，研究发现PI3K/Akt 信号通路参与促炎细胞因子如 TNF-α的调节和释放，并在UC的发生、发展中发挥重要作用[10]。朱锐等[9]通过奥曲肽治疗UC模型大鼠发现AKT1表达明显下降。STAT3通过调节幼稚 CD4+T 细胞向 T 辅助 Th17 或调节性T细胞(Treg)的分化，作为炎症反应的调节剂。研究发现白藜芦醇能够降低VEGFA基因的表达从而减轻UC小鼠的症状[11]。上述靶点在UC的发生、发展、转归中发挥重要作用。上述靶点可能是临床上党参代替白术发挥治疗作用的靶点。此外，人参与党参相比，具有更强的药效，本研究发现RS组特有的靶点包括白细胞介素6(IL-6)、肿瘤细胞抗原p53(TP53)与UC联系紧密。其中IL-6是一种促炎细胞因子，小鼠模型显示，IL-6通过激活STAT3刺激肠上皮细胞的激活、增殖和向癌症发展[12]。P53 肿瘤抑制蛋白是调节基因组完整性、细胞周期和细胞凋亡的关键因子之一，有研究发现p53 的突变可能是进展性UC的早期生物标志物[13]。这些靶点可能是人参-白术药对特有的作用机制。而酪氨酸激酶受体2(ERBB2)是DS组特有的靶点，ERBB2是表皮生长因子受体(EGFR)家族成员之一，研究表明ErbB2通过促进结肠上皮细胞存活，在损伤后的结肠上皮中具有重要的细胞保护和修复作用[14]。对ERBB2靶点的调节可能是党参-白术药对治疗UC的特有作用机制。

通过对KEGG过程分析比较发现，两组共同通过细胞因子-细胞因子受体相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)信号通路对UC起主要治疗作用。细胞因子是炎症的关键调节剂，通过与靶细胞表面的特定受体结合来诱导反应。UC 的免疫反应和炎症通路表明，细胞因子与其受体的相互作用是导致组织损伤的因素之一，其中促炎细胞因子(TNF-α、IL-1、IL-6、IL-9、IL-13和IL-33在上调中起重要作用，而抗炎细胞因子(TGF-β、IL-10 和 IL-37)在疾病进展的下调中起重要作用[15]。此外，本研究表明RS组还可以通过氧化磷酸化、溶酶体和吞噬体通路对UC发挥作用。吞噬细胞表面的特异性受体识别颗粒表面的配体时，就会形成吞噬体，吞噬体通过与循环内体、晚期内体和溶酶体相互作用获得消化特征，溶酶体通过包括内吞作用、吞噬作用和自噬在内的一系列过程获得消化物质。研究发现慢性结肠炎大鼠结肠组织中分离的LPM溶酶体数量和活性明显减少，促炎细胞因子水平升高，抗炎细胞因子水平降低[16]。两组药对共同通过蛋白质磷酸化的正调控、激素水平的调节和对肽的反应等生物学过程对UC发挥治疗作用。对以上KEGG信号通路和GO生物学过程的调控，可能是党参代替白术治疗UC的共有机制。

通过比较RS组和DS组的细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路发现，党参主要通过甾醇类、黄酮类和三萜类等化合物对UC发挥治疗作用，而人参主要通过人参皂苷发挥作用。其物质基础存在较大差异，但两者在药效发挥方面较为类似。有临床研究表明在部分慢性轻证如慢性溃疡，以及在补益剂如四君子汤中可以用党参代替人参[17，18]。动物实验发现人参能够治疗脾虚大鼠，可以提高脾脏免疫功能，党参功同人参而力弱[19]。这些结果与网络药理学研究结果类似，即，党参治疗UC的作用机制与人参相似，初步研究表明人参有大于75%的机制可以在党参中发现，这佐证了党参作用弱于人参，也可以为临床上党参替代人参治疗UC提供了一定科学依据。

综上所述，本文应用网络药理学方法，从成分-靶点-通路多方面进行研究发现，虽然人参和党参配伍白术后治疗溃疡性结肠炎的作用成分虽然不同，但是发挥治疗作用的核心靶点、关键通路和生物学过程相似。本研究为临床上常用党参代替人参与白术配伍治疗溃疡性结肠炎提供了一定的科学依据。