藏药龙胆花药用品种和质量标准研究

樊锦雅，李瑞兰，钟世红，古锐▲

(1.成都中医药大学 药学院，四川 成都 611137；2.成都中医药大学 民族医药学院，四川 成都 611137；3.西南民族大学 药学院，四川 成都 610041)

藏药“龙胆花”来源于龙胆科Gentianaceae龙胆属Gentiana多种龙胆植物不含基生叶的带花地上部分，9月花盛开时采收，晒干使用，主要分布于西藏、四川、青海、甘肃等地，具有解毒及治疗各种热症、喉炎热闭的功效，属于藏药“榜间”大类的一种。“榜间”始载于8世纪中期的《月王药诊》[1]，藏医药文献常采用“分类式”的形式来记载“榜间”：如《晶珠本草》[2]记载，榜间根据颜色分为白花、蓝花、黑(青)花3种，分别称为“榜间嘎保”“榜间完保”和“榜间那保”。但药材市场上常根据花色将其称为“蓝花龙胆”(亦简称“龙胆花”)和“白花龙胆”两类藏药材。“龙胆花”与“白花龙胆”在临床用法、功效上相似，常用于治疗支气管炎、肺炎等疾病。由于“白花龙胆”资源量少、市场价格较高，因此“龙胆花”常作为“白花龙胆”的替代品使用，在市场上供应量大、企业使用较多。

目前龙胆花的市场使用品种混乱，临床上混用、误用等问题突出，质量标准不规范，无法对用药提供有效帮助。因此本研究基于对龙胆花野生资源与市场使用品种调查、实际应用功效分析，并与现有质量标准进行对比，提出修改意见。根据《中国药典》2020年版中相关规定[3]对“龙胆花”主流品种进行显微法、薄层色谱法定性鉴别，对其水分、灰分、浸出物等进行检查、并对“龙胆花”环烯醚萜类成分和黄酮类成分进行含量测定和限度制定，以期为“龙胆花”的质量标准提升提供数据支撑和有效参考。

1 材料

1.1 实验药材

本次研究所用“龙胆花”药材来源于四川、青海、甘肃和西藏地区，包括自采药材，藏医院、藏药厂、藏药市场收集药材共43批，其中自采药材22批，收集的药材21批。所有样品均由重庆中药研究所秦松荣研究员、张植玮助理研究员、成都中医药大学古锐教授鉴定为蓝玉簪龙胆G.veitchiorumHemsl.、线叶龙胆G.farreriBalf.f.、华丽龙胆G.sino-ornataBalf.f.、青藏龙胆G.futtereriDiels et Gilg。药材产地与批次见表1。

表1 龙胆花样品产地与批次

1.2 试剂与药物

马钱苷酸对照品(批号:PS012095,纯度≥98.5%)、龙胆苦苷对照品(批号:PS010423,纯度≥99%)、异荭草苷对照品(批号:PS011444,纯度≥98.5%)均购自成都普思生物科技股份有限公司；硅胶GF254薄层板购自青岛海洋化工厂；分析纯甲醇、诺尔施HPLC级磷酸均购自成都市科隆化学品有限公司；色谱纯甲醇购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；水为超纯水。

1.3 实验仪器

岛津2030(C)型高效液相(日本岛津制作公司)；FA1004电子天平(十万分之一，上海良平仪器仪表有限公司)；BSA124S电子天平(万分之一，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；SB-52000型超声波清洗器(宁波新艺超声设备有限公司)；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱(巩义市予华仪器有限责任公司)；8-10型箱式电阻炉(中国沈阳市节能电炉厂制造)；ΜLUP-1-10T型超纯水机(成都优普超纯水科技有限公司)。

2 方法与结果

2.1 鉴别

2.1.1 性状鉴别

对龙胆花4个品种共43批药材性状进行研究。结果表明不同基原的龙胆花药材的性状差异较小，无明显区别点，因此在4个品种的性状鉴别上不做区分。鉴别结果显示本品呈长条形，略扭曲，长5-15 cm，茎类圆形，断面中空；茎生叶多于基部愈合，向上渐密，矩圆状披针形或线状披针形；花多顶生，基部包围于上部叶丛中，无花梗；花萼筒形，萼筒常带紫红色，花丝淡蓝色；花多皱缩呈钟状，湿展后，萼钟状，顶端5裂，萼齿线形，花冠倒锥状圆筒形，上部深蓝色或亮蓝色，下部黄绿色，具深蓝色条纹和斑点，斑点少见或无，长5-6 cm；雄蕊5枚，棕黄色或黄白色，着生于冠筒中部，整齐，花药狭矩圆形；花柱线形，子房披针形，柱头两裂。气清香，味苦。“龙胆花”药材图见图1。

图1 “龙胆花”药材图

2.1.2 显微鉴别

取龙胆花4个基原品种药材粉末(4号筛)(水合氯醛透化，稀甘油装片)在显微镜下观察。结果表明4个品种在显微特征方面无显著差异，不能作为品种间的鉴别要点，故建立“龙胆花”显微鉴别，不做各品种间显微特征区别。鉴别结果如下：本品粉末草绿色或黄绿色；叶表皮细胞类长方形，垂周壁呈波状弯曲，连珠状增厚，具角质线纹，气孔不定式，副卫细胞3-6个。花瓣碎片上表皮细胞呈乳突状，具有细密的角质层纹理和油滴；下表皮细胞垂周壁呈浅波状弯曲，弯曲处突出呈脊，脊呈研棒状。纤维众多成束，偶见零散分布。柱头及花柱上部表皮细胞分化成圆锥形的单细胞毛，先端较尖或稍钝。薄壁细胞多见细小的草酸钙柱晶，偶见方晶。花粉粒橘黄色，呈类球形、椭圆形、钝三角形，直径25-42.5 μm，表面光滑，偶见外壁具细刺状突起，萌发孔3个；螺纹导管，直径7.5-12.5 μm。龙胆花药材粉末的显微鉴别图见图2。

注:1-叶表皮细胞;2-呈连珠状增厚的表皮细胞;3-花柱碎片;4-含草酸钙结晶的薄壁细胞;5-纤维束;6a-花瓣碎片上表皮细胞;6b-花瓣碎片下表皮细胞;7-螺纹导管;8-花粉粒

2.1.3 薄层色谱鉴别

取龙胆花粉末1 g，加甲醇10 mL，超声处理30 min，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。取对照药材粉末1 g，同法制成对照药材溶液。另取马钱苷酸对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液4 μL，对照品溶液3 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(7∶1∶1∶0.4)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点(图3)。

注:S为马钱苷酸;DZYC为“龙胆花”对照药材;LYZ1-QZ5为不同品种不同批次供试品

2.2 检查项

按照《中国药典》2020年版四部通则，对水分(通则0832下烘干法)、总灰分(通则2302)、酸不溶性灰分(通则2302)、浸出物(通则2201)进行检查。基于测定结果，考虑到药材来源的差异，各取其平均值上浮20%，最终初步拟定龙胆花药材水分不得过11.0%，总灰分不得过5.0%，酸不溶性灰分不得过1.50%，浸出物不得少于25.0%。具体结果见表2。

表2 龙胆花样品各批次水分、灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量测定结果 n=2，%

2.3 含量测定

根据课题组前期建立的龙胆花“一测多评”法测定“龙胆花”中环烯醚萜类和黄酮类成分的含量[4]。

2.3.1 对照品溶液的制备

精密称取龙胆苦苷对照品、异荭草苷对照品，加甲醇制成每1 mL含龙胆苦苷0.256 2 mg、异荭草苷0.324 6 mg的混合对照品，于4℃冰箱避光保存，备用。

2.3.2 供试品溶液的制备

取本品粉末(过3号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min(功率250 W，频率50 Hz)，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.3.3 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱为InertsilODS-3(5 μm,4.6×250 mm,柱号:5020-01732),流动相为0.2%磷酸水溶液(A相),甲醇(B相),梯度洗脱:0-5 min,20%-24%甲醇;5-42 min,24%-37%甲醇;4-52 min,37%-38%甲醇;52-62 min,38%-40%甲醇;62-72 min,40%-20%甲醇。体积流量1.0 mL/min;进样量10 μL;检测波长240 nm;柱温30℃。

2.3.4 样品含量测定

基于课题组前期制定的一测多评(QAMS)方法对样品含量进行计算分析[4]，相对保留时间及校正因子见表3、表4，计算7种成分的相对保留时间进行峰定位，再以龙胆苦苷的峰面积为对照，分别乘以校正因子，计算龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷的含量；以异荭草苷的峰面积为对照，分别乘以校正因子，计算异荭草苷、异金雀花素苷、异金雀花素的含量。

表3 环烯醚萜类的相对保留时间及相对校正因子

表4 黄酮类的相对保留时间及相对校正因子

计算结果显示，39批龙胆花样品中，环烯醚萜类成分(马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷)含量为2.18%-8.48%，黄酮类成分(异荭草苷、异金雀花素-2"-O-吡喃葡萄糖苷、异金雀花素)含量为0.38%-2.00%。考虑到质量标准制定的适用性和药材来源的差异性，本研究拟基于测定结果，各取其平均值上浮20%，初步拟定本品含环烯醚萜类成分[龙胆苦苷(C17H26O4)、马钱苷酸(C16H24O10)、獐牙菜苦苷(C16H22O10)、獐牙菜苷(C16H22O9)]的总量不得少于3.00%；含黄酮苷类成分[异荭草苷(C21H20O11)、异金雀花素-2"-O-吡喃葡萄糖苷(C28H32O16)、异金雀花素(C22H22O11)]的总量不得少于0.50%。具体结果见表5。色谱图见图4。

注:1-龙胆苦苷对照品;2-异荭草苷对照品;A-混合对照品;B-“龙胆花”供试品

表5 QAMS法测得39批“龙胆花”中环烯醚萜类和黄酮类的含量 n=2,%

3 讨论

3.1 定性和定量分析指标的选择

据课题组前期对“龙胆花”主流品种进行化学成分分离鉴定的结果，龙胆花主要含环烯醚萜苷和黄酮苷类化合物，具抗炎镇痛、止咳平喘等功效，“龙胆花”化学成分主要包括以马钱苷酸[5，6](抗炎、抗菌)、龙胆苦苷[7](有抑制炎症反应、抗氧化应激、抗纤维化、抗细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖等药理作用)等为主的环烯醚萜类成分和以异荭草苷[8](抗氧化、抑制炎症发展、改善胰岛素抵抗、弱化肝纤维化发展以及诱导肝癌细胞凋亡等药理作用)、异金雀花素等为代表的黄酮类成分，现代药理研究表明这些化合物均为龙胆花的主要有效成分。

《中国药典》2020年版一部中收载的同科同属植物“龙胆”药材以龙胆苦苷为对照品进行薄层鉴别和含量测定，但通过课题组前期采用HPLC指纹图谱法和对不同产地、不同品种的52批龙胆花样品化学成分差异的研究，发现龙胆苦苷在少部分样品中检测不到，无法对部分龙胆花品种起到完全有效的鉴别，而马钱苷酸在所有检测样品中均可检测到，后在含量测定中也得到了同样的结果。因此薄层鉴别选择马钱苷酸为定性指标，总环烯醚萜和总黄酮为含量定量指标。

3.2 薄层鉴别条件的选择与考察

本研究选择马钱苷酸进行薄层鉴别，并考察了不同展开系统、不同点样量(2、4、6、8、10 μL)、不同显色条件(254 nm、可见光)，结果表明以乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(7∶1∶1∶0.4)为展开剂，供试品溶液4 μL、对照品溶液3 μL时，样品中的马钱苷酸能得到良好的分离。耐用性考察(温度4℃、25℃、35℃；湿度32%、47%、65%、88%)结果表明该条件下马钱苷酸均能得到很好的分离，说明该TLC鉴别方法可行。

3.3 浸出物测定条件的考察

本研究参照《中国药典》2020年版对龙胆花浸出条件进行了考察，考察了冷浸法和热浸法，以及浸出溶剂(水，25%、50%、75%、100%乙醇)，结果表明，以水热浸时浸出效果最好，浸出率最高。最终选择水热浸法作为浸出物的测定条件。

3.4 含量测定指标成分的选择和结果分析

本研究通过对龙胆花7种有效成分含量测定发现，不同品种间及同品种不同产地间的龙胆花样品中各成分平均含量差异较大，其中龙胆苦苷、獐牙菜苦苷和异金雀花素在部分样品中含量很低或没有，例如4个品种均有不含异金雀花素的批次，并且大多为四川省内的自采样品，这可能与样品的生长环境、海拔、生长年限和采收时间等因素有关，也表明龙胆花在不同成分的含量上可能具有产地优势；此外，4个品种在不同化学成分含量上虽有差异但未表现出明显的趋势，表明本研究以环烯醚萜总量和黄酮总量作为龙胆花含量测定限度指标的可行性和合理性，不同化学成分的含量差异可为龙胆花的优劣评价和龙胆花的不同产地的化学成分研究提供相关参考。

3.5 基于品种使用现状、资源现状的药材名称、基原品种、药用部位修改建议

3.5.1 药材名称的修订建议

本次研究发现，在近些年的市场实际应用中该药材的药材名、基原品种、药用部位均与标准存在较大出入。藏医药文献常采用“分类式”的形式来记载“榜间”，如《晶珠本草》[2]中“榜间”根据颜色分为白花、蓝花、黑(青)花3种，分别称为“榜间嘎保”“榜间莪保”和“榜间那保”；《中华人民共和国卫生部药品标准·藏药(第一册)》(后简写为《部颁藏标》)因此收载“榜间那保”，汉文名为“青藏龙胆”。《四川省中药材标准》[9](2010年版)收载蓝玉簪龙胆G.veitchiorumHemsl，根据花色，命名为“蓝花龙胆”，藏语汉译音为“榜间莪保”(蓝花榜间)。品种整理表明[10]，因对花色深浅的主观认识不同，藏医对于“蓝花”“黑花”的辨析并不明确，同样的品种在不同的文献中可能出现在不同的分类中。相对于藏医对“蓝色”的深浅辨析，药材市场上的汉文称呼关注其主色，直接称之“蓝花龙胆”，或称之“龙胆花”，与“白花龙胆”进行区别。此外本研究在藏医院、藏药厂、市售药材中鉴定出多种多枝组龙胆，其中蓝玉簪龙胆和线叶龙胆批次最多，也是多种基原品种混合在一起使用的主要品种来源，而青藏龙胆并非其主流药材。原标准中“青藏龙胆”药材名不能反映药材基原的客观使用情况，若直译为“黑花龙胆”不能反映其以蓝色深浅作为辨识依据的命名原则；若使用“蓝花龙胆”不能反映其传统分类，且易造成与“榜间莪保”混淆。

综上所述，按照本草记载、传统药材分类、市场上药材习惯叫法及多基原使用现状，且藏医临床使用并没有严格区分榜间莪保和榜间那保，建议其药材名修订为“龙胆花”，藏文名和藏语汉文音译不变，该名称既能反映其多基原品种特点，又能反映其用药部位，能够和“白花龙胆”进行区分，与市场上广泛使用的药材汉文名一致，符合传统认知。

3.5.2 来源的修订建议

本品在《部颁藏标》中来源于青藏龙胆G.przewalskiiMaxim.及同属数种植物的干燥花。G.przewalskiiMaxim.此名最早出现在Mel.Biol.Acad.Sci.St.Petersb.(1881年)，随后《青藏高原药物图鉴》(第2册)[11](1978年)，《中国民族药志》(第2卷)[12](1990年)、《部颁藏标》(1995年)[13]和《中国藏药》(1996年)引用了该拉丁名。《中国植物志》62卷(1988年)在云雾龙胆GentiananubigenaEdgew.的“文献参考”部分记录了该拉丁名，云雾龙胆花冠上部蓝色，下部黄白色，与《青藏高原药物图鉴》(第2册)[11]所记录的G.przewalskii花冠筒淡黄色有明显相异。调查表明，云雾龙胆G.nubigenaEdgew.确被藏医识认为“榜间嘎保”一种使用，但《中国植物志》记载本植物“萼片裂片直立，不整齐，狭矩圆形”，与《部颁藏标》药材性状中“萼齿线形”有较大差异，应不为记述的同一个品种。各文献G.przewalskii所记录植物性状与《部颁藏标》中记载的药材性状有诸多矛盾之处。因此，本研究认为原标准《部颁藏标》中收载的G.przewalskii可能为误定，应考虑进行修订。

此外，本次实验中收集到“龙胆花”商品药材共29批，其中蓝玉簪龙胆、线叶龙胆、华丽龙胆和青藏龙胆为“龙胆花”商品药材的主流品种。为扩大药源，故根据所收集的藏医院、藏药厂、市场药材来源情况，参考《中国药典》“淫羊藿”项下品种收录范例，拟定“龙胆花”来源为龙胆科龙胆属植物蓝玉簪龙胆G.veitchiorumHemsl.、线叶龙胆G.farreriBalf.f.、华丽龙胆G.sino-ornataBalf.f.、青藏龙胆G.futtereriDiels et Gilg等同属近似种植物。

3.5.3 入药部位的修订建议

原《部颁标准》中收载药用部位为“干燥花”。文献记载，“榜间”主要以花入药，《晶珠本草》[2]将其纳为旱生草本花入药类藏药。但因采收习惯，市场上多以花枝入药，仅有精品药材选用花朵且价格较为昂贵。本研究对收集的龙胆花商品药材进行鉴定分析后发现，藏医院、药厂、市场所用或所售龙胆花药用部位均为不含基生叶的带花地上部分，而非现有标准的制订的花或全草。此外，龙胆花资源逐年萎缩，仅收集花部分，难以满足市场需求量，还会造成有同等价值的花枝部分资源的浪费。为保障临床用药安全有效，应修订药用部位，在提高市场供应量的同时提高资源的利用率。综上所述，建议药用部位修改为“不含基生叶的带花地上部分”。