HPLC 法同时测定除湿防疫颗粒中11 种成分

2023-11-23隋欣彤胡力铭王仁广李小欢王淑敏

中成药 2023年11期

隋欣彤，董欣，胡力铭，王仁广，李小欢，王淑敏

（长春中医药大学药学院，吉林长春 130117）

除湿防疫颗粒是一种中药复方制剂，由黄芩、赤芍、连翘、当归、生地黄、生黄芪、黄连、黄柏、芦根、生薏苡仁、桃仁、冬瓜子、浙贝母、知母组成，具有清热解毒、止咳平喘功效，以清热药为主，清肺化痰药、补气血药为辅，共同作用于上焦，加强肺卫之气，抵御外邪。方中黄芩［1-2］、黄柏［3］、知母［4］、芦根［5］、赤芍［6］等为清热药，而黄芪［4］、浙贝［7］、冬瓜子［8］等为清肺补气血药。

中药复方制剂成分复杂多样，其作用往往是协同效应，故对多成分进行质量控制已成为相关研究的发展方向［9-12］。本实验采用HPLC 法同时测定除湿防疫颗粒中黄芩、赤芍、黄柏、黄连、桃仁、连翘、知母、黄芪、当归主要成分黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、芍药苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、盐酸小檗碱、苦杏仁苷、连翘苷、芒果苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸的含量，以期为该制剂质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器 LC-20AT 高效液相色谱仪，配置DAD检测器（日本岛津公司）； DE-100 型高速万能粉碎机（浙江红景天工贸有限公司）； AB135-S 型电子分析天平（十万分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司）； FD 中试冻干机［金西盟（北京）仪器有限公司］； C21-SDHCB15 多功能电磁炉（浙江苏泊尔股份有限公司）； SB-4200DT 超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 试剂与药物黄芩（产地山西）、赤芍（产地内蒙）、连翘（产地河南）、当归（产地甘肃）、生地黄（产地河南）、生黄芪（产地内蒙）、黄连（产地四川）、黄柏（产地四川）、芦根（产地河北）、生薏苡仁（产地贵州）、桃仁（产地河北）、冬瓜子（产地山东）、浙贝母（产地浙江）、知母（产地河北）均购自安国市安兴中药饮片有限公司，经长春中医药大学药学院王淑敏教授鉴定为正品，符合2020 年版《中国药典》相关规定。除湿防疫颗粒（自制，方法为取总药材183 g，加10 倍量水煎煮2 次，每次2 h，滤过，滤液冻干成粉末，加入乳糖、淀粉制粒，即得，每粒10 g，批号210402、210405、210408、210411、210414、210417）。苦杏仁苷（批号B20687）、黄芩素（批号B20571）、盐酸黄柏碱（批号B21437）、汉黄芩素（批号B20489）对照品均购自上海源叶生物科技有限公司；连翘苷（批号110821-201514）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号18031920）对照品均购自中国食品药品检定研究院；黄芩苷（批号DSTDH002301）、盐酸小檗碱（批号DST191113-009）、芒果苷（批号DST190305-031）、阿魏酸（批号 DST191022-001 ）、芍药苷（批号DSTDS007001）对照品均购自成都德思特生物技术有限公司。乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters XBridge BEH C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A） -0.1%磷酸（B），梯度洗脱，程序见表1；体积流量1.0 mL/min；柱温35 ℃；检测波长210、230、258、280、330 nm；进样量10 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 供试品溶液制备取本品适量，粉碎成粉末，精密称取0.2 g，置于50 mL 锥形瓶中，精密加入20 mL 80% 甲醇，摇匀，称定质量，超声处理40 min，冷却至常温，80%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液制备精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖、阿魏酸、汉黄芩素、盐酸小檗碱、黄芩苷、黄芩素、盐酸黄柏碱、芒果苷、连翘苷、苦杏仁苷、芍药苷对照品适量，甲醇溶解并制成质量浓度分别为1、1、1、1、1、0.5、0.5、0.5、0.25、2、2 mg/mL 的溶液，即得。

2.4 阴性样品溶液制备按照处方工艺，分别制成缺黄芪、缺当归、缺黄芩、缺黄连、缺黄柏、缺知母、缺连翘、缺桃仁、缺赤芍的阴性样品，按“2.2” 项下方法制备，即得。

2.5 专属性试验量取“2.2” “2.3 “ “2.4” 项下溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1～2。由此可知，各成分色谱峰均有良好的分离度，理论塔板数大于3 000，阴性样品溶液中除盐酸小檗碱以外的成分无干扰（黄连、黄柏含有盐酸小檗碱），表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

图2 阴性样品HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of negative samples

2.6 线性关系考察将“2.3” 项下对照品溶液中的盐酸小檗碱、苦杏仁苷、连翘苷、芒果苷、黄芩素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、盐酸黄柏碱、阿魏酸、汉黄芩素质量浓度稀释至0、2、4、8、16、32、64 μg/mL，芍药苷质量浓度稀释至0、5、10、20、40、80、160 μg/mL，黄芩苷质量浓度稀释至50、100、200、300、400、500、600 μg/mL，在“2.1” 项色谱条件下进样测定3 次。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.7 精密度试验精密吸取“2.3” 项下对照品溶液10 μL，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6次，测得黄芩苷、芍药苷、盐酸小檗碱、苦杏仁苷、连翘苷、芒果苷、黄芩素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、盐酸黄柏碱、阿魏酸、汉黄芩素峰面积RSD分别为0.69%、0.35%、0.86%、0.17%、0.84%、0.94%、0.76%、0.62%、0.45%、0.79%、0.83%，表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验取本品6 份，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得黄芩苷、芍药苷、盐酸小檗碱、苦杏仁苷、连翘苷、芒果苷、黄芩素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、盐酸黄柏碱、阿魏酸、汉黄芩素峰面积RSD 分别为 0.51%、0.39%、0.29%、1.79%、1.22%、1.75%、1.31%、1.04%、1.55%、1.05%、0.35%，表明该方法重复性良好。

2.9 稳定性试验取同一份本品，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，室温下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得黄芩苷、芍药苷、盐酸小檗碱、苦杏仁苷、连翘苷、芒果苷、黄芩素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、盐酸黄柏碱、阿魏酸、汉黄芩素峰面积RSD 分别为1.29%、1.06%、1.00%、0.80%、0.38%、0.43%、1.48%、1.25%、1.23%、0.83%、1.05%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.10 加样回收率试验精密称取各成分含量已知的本品（批号210404） 6 份，每份0.1 g，按100%水平精密加入“2.3” 项下对照品溶液适量，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，黄芩苷、芍药苷、盐酸小檗碱、苦杏仁苷、连翘苷、芒果苷、黄芩素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、盐酸黄柏碱、阿魏酸、汉黄芩素平均加样回收率（RSD）分别为 100.12% （0.95%）、102.04% （1.28%）、93.33% （1.41%）、104.03% （1.54%）、98.66%（1.88%）、96.99% （2.11%）、97.07% （0.68%）、100.86% （1.60%）、95.83% （1.38%）、101.50%（1.88%）、97.55% （1.79%）。

2.11 含量测定取6 批样品，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算含量，平行3 次，结果见表3。

表3 各成分含量测定结果（mg/g，n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents （mg/g，n＝3）

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法选择本实验根据除湿防疫颗粒中各成分的理化性质，选择不同体积分数甲醇作为溶剂进行超声提取，并考察了不同超声时间的效果。结果，超声时间为40、50、60 min 时各成分含量均无明显差异，最终确定80% 甲醇超声处理40 min 作为供试品溶液制备方法。

3.2 色谱条件选择本实验参考2020 年版《中国药典》［13］，比较甲醇-10 mmol/L 甲酸铵（氨水调pH 至8）、甲醇-5 mmol/L 磷酸二氢铵溶液等流动相的分离效果。结果，乙腈-0.1%磷酸作为流动相梯度洗脱71 min 时，各成分色谱峰峰形良好，基线平稳，分离度理想，理论塔板数均大于3 000。

3.3 检测波长选择由于除湿防疫颗粒成分复杂多样，故本实验参考文献［1-8，14-21］报道，利用二极管阵列紫外检测器的优点，考察不同检测波长下色谱峰数目、分离度、峰面积。最终，采用“2.1” 项下多波长检测，此时各成分色谱峰均有较好的分离度，并且干扰较少。