六味地黄丸入血、入脑成分分析

张 雪，佟玉良，夏天利，左 坤，于 浩，王 迪，张 宁，赵继会，雷 霞

（1.佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007； 2.无锡市中医医院，江苏省中医退行性骨关节病临床医学创新中心，江苏 无锡 214071； 3.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040； 4.湖南医药学院药学院，湖南 怀化 418000）

六味地黄丸为滋阴补肾经典名方，其中熟地黄、山茱萸、山药为三补组分，有肾、肝、脾三脏同补的功效； 牡丹皮、茯苓、泽泻为三泻组分，有降相火、利水渗湿的功效［1］。前期报道，熟地黄成分以环烯醚萜苷类为主［2］，山茱萸成分以环烯醚萜类、多酚类为主［3］，山药成分以甾体皂苷类、呋喃甾烷类为主［4］，茯苓成分以多糖类、萜类为主［5］，泽泻成分以萜类为主［6］，牡丹皮成分以黄酮类、酚类、糖类为主［7］。临床研究表明，六味地黄丸改善老年人学习记忆能力、抑郁障碍、焦虑障碍等中枢神经系统疾病的效果良好［8］，并且近年来课题组开展了关于其增强学习记忆功能、减轻情感障碍方面的研究［9］。

由于药物通过吸收入血进行体内分布，大部分在到达靶器官后发挥药效，故鉴定六味地黄丸入脑成分对确定其防治神经系统疾病的药效物质基础至关重要。本实验采用超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱 （UPLC-LTQ-Orbitrap-MS） 法，对六味地黄丸给药后吸收成分进行快速鉴定，并通过分析入血成分来确定入脑成分，以期为该制剂药效物质基础研究提供依据。

1 材料

1.1 动物 SPF 级健康SD 大鼠12 只，雄性，3 ～4 月龄，体质量（230±20） g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（辽） 2020-0001，无菌环境饲养，温度 （21 ±1）℃，相对湿度（60±5）%，适应性饲养1 周，自由进食饮水。操作流程均符合实验动物管理、保护的相关规定。

1.2 试剂与药物 六味地黄丸（浓缩丸，北京同仁堂药店佳木斯店）。甲醇为色谱纯（北京迪马欧泰科技发展中心）； 乙腈为色谱纯（美国赛默飞世尔科技公司）； 甲酸为色谱纯（美国Tedia 公司）。

1.3 仪器 UltiMate 3000 超高液相色谱仪、LTQOrbitrap 质谱仪 （美国赛默飞世尔科技公司）；Milli-Q 纯水器［密理博（上海） 贸易有限公司］；Mikro 200R 离心机（德国Hettich 公司）

2 方法

2.1 溶液制备

2.1.1 药液 取本品适量，研细，精密称取5.45 g，超声处理1 h，搅拌均匀，即得。

2.1.2 供试品溶液 取本品适量，研细，精密称取0.500 g，加入50% 甲醇25 mL，加热回流1 h，在-20 ℃下保存，使用时取0.5 mL，置于5 mL 量瓶中，70%甲醇定容，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.2 血浆、脑脊液采集 大鼠适应性饲养7 d 后随机分为空白组、给药组，每组6 只，实验前12 h禁食不禁水，空白组大鼠灌胃给予2 mL 双蒸水，给药组大鼠灌胃给予等量“2.1.1” 项下药液，于0.5、1、1.5、2 h 眼框取血，置于肝素钠离心管中，4 ℃、21.382×g离心10 min，取上层血浆，在-80 ℃下保存。取血后将大鼠头部固定，输液针从皮肤穿入，抵达小脑延髓池抽取脑脊液，4 ℃、21.382×g离心10 min，取上层清液，在-80 ℃下保存。

2.3 样品处理

2.3.1 血浆 取空白、含药血浆各300 μL，置于离心管中，加入2 mL 甲醇，30 μL 乙酸涡旋混合1 min，超声处理1 min，4 ℃、21.382×g离心10 min，取上清液，氮吹后用150 μL 70% 甲醇复溶，过0.22 μm 微孔滤膜。

2.3.2 脑脊液 取空白、含药脑脊液各200 μL，置于离心管中，加入800 μL 甲醇，按 “2.3.1”项下方法处理。

2.4 UPLC-LTQ-Orbitrap-MS 分析条件 同文献［9-10］ 报道。

2.5 数据处理 采用Thermo Scientific Xcalibur 软件。

3 结果

根据色谱保留时间、分子碎片峰、数据库，将二级质谱裂解碎片离子信息结合相关文献进行比对，最终鉴定出38 种入血成分，包括环烯醚萜苷类、有机酸类、萜类、挥发油类、苯丙素类、苯丙胺类、呋喃类、酚酸类、糖苷类、酯类、酚类、其他类，其中29 种为原型成分，9 种为其代谢产物；鉴定出10 种原型入脑成分，其中没食子酸、阿魏酸、5-羟甲基糠醛、原儿茶醛、缬草素、咖啡酸是首次发现，具体见图1～4、表1～2。

表1 六味地黄丸入血、入脑成分鉴定结果Tab.1 Results of components migrating to blood and brain identification in Liuwei Dihuang Pills

图1 六味地黄丸入血成分UPLC-LTQ-Orbitrap-MS总离子流图Fig.1 UPLC-LTQ-Orbitrap-MS total ion current chromatograms of components migrating to blood in Liuwei Dihuang Pills

图2 六味地黄丸入脑成分UPLC-LTQ-Orbitrap-MS总离子流图Fig.2 UPLC-LTQ-Orbitrap-MS total ion current chromatograms of components migrating to brain in Liuwei Dihuang Pills

图3 六味地黄丸入血、入脑成分提取离子流图（正离子模式）Fig.3 Extracted ion current chromatogram of components migrating to blood and brain in Liuwei Dihuang Pills （positive ion mode）

图4 六味地黄丸入血、入脑成分提取离子流图（负离子模式）Fig.4 Extracted ion current chromatogram of components migrating to blood and brain in Liuwei Dihuang Pills （negative ion mode）

3.1 入血、入脑成分质谱裂解分析

3.1.1 有机酸类 该类化合物在质谱中容易丢失CO、CO2、-COOH、H2O 等，产生碎片离子峰。以化合物29 为例，在保留时间2.56 min （负离子模式） 处准分子离子峰为m/z179.035 0 ［M-H］-，推测其分子式为C9H8O4； 二级质谱中m/z107.83处可见碎片离子［M-H-CO2-CO］-，与数据库、文献［11］ 比对后确定为咖啡酸，二级碎片离子图见图5。

图5 咖啡酸二级碎片离子图Fig.5 Secondary fragment ion diagram for caffeic acid

3.1.2 环烯醚萜苷类 该类化合物是由单萜与糖结合成的糖苷，其糖苷键易断裂，得到丢失一分子或几分子糖的碎片离子，由于其结构中常存在羟基，导致容易中性丢失H2O，产生质量损失18 Da的碎片离子。以化合物25 为例，在保留时间4.82 min （负离子模式） 处，准分子离子峰为m/z375.129 7 ［M-H］-，推测其分子式为C16H24O10；在高能碰撞离子作用下，主要二级碎片离子为m/z213.08 ［M-H-C6H10O5］-、169.08 ［M-H-C6H10O5-CO2］-、113.02 ［M-H-C10H14O5-H2O-CH2O］-，与数据库、文献［11］ 比对后确定为马钱苷酸，二级碎片离子图见图6。

图6 马钱苷酸二级碎片离子图Fig.6 Secondary fragment ion diagram for loganic acid

3.1.3 其他类 以化合物8 为例，在保留时间2.13 min （正离子模式） 处，准分子离子峰为m/z127.039 0 ［M+H］+，推测其分子式为C6H6O3； 二级质谱中依次失去H2O、CO，形成碎片离子m/z109.04 ［M+H-H2O］+、81.05 ［M+H-H2O-CO］+，与数据库、文献［10］ 比对后确定为5-羟甲基糠醛，二级碎片离子图见图7。

图7 5-羟甲基糠醛二级碎片离子图Fig.7 Secondary fragment ion diagram for 5-hydroxymethylfurfural

3.2 代谢产物结构鉴定 表2 显示，大鼠血浆中鉴定出丹皮酚代谢产物2 个［12］，分别为硫酸化、羟基化； 没食子酸代谢产物3 个［13］，分别为甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸酯化； 咖啡酸代谢产物2个［14］，分别为硫酸酯化、一分子葡萄糖醛酸结合；阿魏酸代谢产物2 个［14］，分别为硫酸酯化、一分子葡萄糖醛酸结合［13］。

表2 丹皮酚、没食子酸、咖啡酸、阿魏酸在大鼠血浆中的代谢产物Tab.2 Metabolites of paeonol，gallic acid，caffeic acid and ferulic acid in rat plasma

4 讨论与结论

虽然关于六味地黄丸及其体内化学成分的分析已有许多报道［15-17］，但由于仪器的局限性或数据库的不足，相关研究仍不够深入。课题组前期从六味地黄丸给药后大鼠血浆中鉴定出21 种入血成分，脑脊液中鉴定出4 种入脑成分［9］，但尚不全面，也未关注其体内代谢情况。本实验设计了4 个采血时间点，并根据UPLC-LTQ-Orbitrap-MS 的高效分离优势，所鉴定到的入脑原型成分增加了6 种。

六味地黄丸入脑、入血成分，甚至代谢产物都有可能是其活性化合物，也是其抗神经损伤的药效物质基础。前期报道，没食子酸具有神经保护作用，其作用机制可能是激活Nrf2/HO-1 通路，从而减轻氧化应激对神经元的损伤［18］； 阿魏酸可减轻氨基酸所致的神经元损伤，发挥神经元保护作用；咖啡酸对慢性铝过负荷大鼠脑损伤有明显的神经保护作用，其机制可能与抑制5-LO、减轻中枢神经系统炎症和氧化应激有关［19］； 缬草素可明显降低大鼠血清皮质酮的含量，其抗焦虑作用可能是通过调节下丘脑-垂体-肾上腺轴功能来实现的［20］； 原儿茶醛通过PLK2/p-GSK3β/Nrf2 途径，从而对帕金森病具有治疗作用［21］； 5-羟甲基糠醛可改善学习记忆能力，可能是通过提高其脑组织抗氧化酶SOD 活性、降低脂质过氧化反应实现的［22］； 5-羟甲基糠醛通过上调GCR 蛋白表达，上调了其下游蛋白BDNF、SGK 表达，调节P-synapsinⅠ蛋白表达，从而在延缓学习记忆功能退化中发挥作用［23］。因此，抑制神经元凋亡、减轻中枢神经系统炎症和氧化应激可能是六味地黄丸主要作用机制。

综上所述，本实验采用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS法对六味地黄丸入血、入脑成分进行分析，共鉴定出38 种入血成分，其中29 种为原型，9 种为代谢产物，同时还鉴定出10 种原型入脑成分，可为该制剂后续质量控制、药效机制探索提供依据。