低声压次声对血管性痴呆大鼠海马功能保护作用的研究

陈翠银 郑碧娥 范建中 何任红

南方医科大学南方医院，广东 广州 510515

血管性痴呆是发生在脑血管疾病后的重度认知障碍，其发病率高，病情迁延反复，预后往往不良［1-2］。研究显示中国年龄＞60 岁人群中，血管性痴呆的发病率约每年2.4/1 000 人［3］，VD 患者的中位生存期缩短［4］。国内的荟萃分析显示，中国中老年社区人口中血管性痴呆的人群病死率高达14.6%［5］。VD的病理改变多样［6］，可表现为皮质梗死、皮层下梗死、腔隙性梗死、白质病变等，尤其是海马的病变在VD 过程中起重要作用，因此通过改善海马功能是改善VD认知功能的重要途径［7-9］。

低声压次声是指声压强度＜90 dB、在安全域内的次声，可以穿过颅骨，通过波动效应作用于脑组织，笔者前期实验证实低声压次声可以缩小梗死灶面积，减少细胞凋亡，增加神经元的可塑性，并促进骨髓间充质细胞增殖［10-12］。目前尚无研究探讨低声压次声是否可促进海马区内源性干细胞分化定向分化，从而改善VD认知功能。本实验探讨低声压次声在改善血管性痴呆大鼠认知功能中的作用，并分析此过程中海马区神经元的变化。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：体质量230～270 g 的雄性SD 大鼠，共24只，由南方医科大学实验动物中心提供。饲养环境为SPF级，实验过程中饲料和饮水自由，干预时在特定实验操作间完成，实验全过程遵守动物福利与伦理原则，并受单位动物伦理委员会的监督。

1.1.2 仪器和试剂：美国CHI 公司次声治疗仪Infrasound（8TM）；TSE 穿梭箱主动和被动逃避实验系统）；日本尼康正置荧光显微镜和成像系统；Abcam兔多克隆Anti-beta ⅢTubulin 抗体，荧光二抗：FITC标记，赛维尔山羊抗兔。

1.2 实验方法将24只SD实验大鼠随机分为假手术组、VD 组和次声组各8 只。各组大鼠分别建模，VD组和次声组大鼠行双侧颈总动脉闭塞手术，假手术组大鼠行假手术。

1.2.1 VD 模型建立：隔开3 d 先后结扎右侧和左侧颈总动脉，假手术切开手术部位并分离找到颈总动脉但不进行结扎。使用水合氯醛（浓度10%，4 mL/kg）进行腹腔注射麻醉，作颈部前正中线旁切口，游离肌肉找到颈动脉鞘，轻轻拨开迷走神经，缝线结扎颈总动脉，缝合伤口，术中保持大鼠恒温。通过比较假手术组和VD 组大鼠在被动躲避试验的行为学表现评价是否建模成功［13］。

1.2.2 干预方法：VD 组大鼠无真实次声干预，次声组大鼠接受真实低声压次声干预，假手术组大鼠不做任何处理，方法为术后24 h开始进行干预，1次/d，60 min/次，为期7 d。次声组接受干预的次声频率4～20 Hz，声强79.75～86.11 dB。

1.2.3 被动躲避试验：大鼠喜暗，会从明箱主动进入暗箱，关门后电击其足底，使大鼠产生被电击的恐惧记忆，通过观察大鼠进入暗箱的迟疑，即步入潜伏期，来评估其认知功能。在建模前，所有大鼠均需适应性训练，保证其躲避潜伏期基本一致，然后再随机分组。在实验第7天对3组大鼠评估，先排除掉步入潜伏期超过100 s的大鼠；30 min后当大鼠自主进入暗箱后关门，接受1.0 mA、持续3 s 的电刺激，2 min后重复进行。训练以大鼠拒绝进入暗箱或留在明箱超过120 s或共接受了3次训练作为结束的标准。次日从明箱进入的大鼠允许在明暗箱间自由活动，记录步入潜伏期。

1.2.4 标本制作：术后第7 天麻醉后剪开胸廓，先用250 mL生理盐水从心尖输入，右心耳流出，冲洗体内血液，然后用多聚甲醛（浓度为4%，约200 mL）进行灌注固定，后完整取出大鼠脑组织并浸泡固定24 h。后续进行常规脱水、透明石蜡包埋，选取海马区作片厚5 μm的连续冠状切片备用。

1.2.5 免疫荧光染色：石蜡切片先行常规脱蜡，用EDTA 抗原修复缓冲液进行5 min 热修复抗原，冷却至室温后再使用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）进行每次5 min的漂洗，共3次；画圈淬灭自发荧光，牛血清白蛋白封闭30 min，加βⅢ-tublin一抗4 ℃孵育过夜，PBS 漂洗，避光室温加山羊抗兔二抗孵育50 min，PBS漂洗，避光室温加DAPI染液孵育10 min，PBS 漂洗甩干后，再用抗荧光淬灭封片剂进行封片。以双侧海马为图像分析区域，荧光显微镜下采集图像，每组取3个（×400）视野，用Image-pro plus 6.0进行处理，计算βⅢ-tublin的累积光密度值。

1.3 统计学分析本研究数据采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，计量资料符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，并采用单因素方差分析进行统计分析，LSD 法两两比较；不符合正态分布时，采用非参数检验方法分析。

2 结果

2.1 被动躲避试验结果潜伏期越短代表认知功能越差，VD组大鼠的步入潜伏期较假手术组显著缩短（P＜0.05），表明VD模型建立成功；次声组大鼠的步入潜伏期比VD 组显著较长（P＜0.05），表明低声压次声治疗可以改善VD大鼠认知功能；进一步比较假手术组和次声组间的步入潜伏期，差异无统计学意义（P＞0.05），表明低声压次声可有效减缓的VD 严重程度。见表1。

表1 各组步入潜伏期比较 （s，±s）Table 1 Comparison of stepping latency in each group（s，±s）

表1 各组步入潜伏期比较 （s，±s）Table 1 Comparison of stepping latency in each group（s，±s）

组别假手术组痴呆组次声组步入潜伏期237.20±125.65 45.04±36.51 144.50±83.90 F值P值9.169 0.001

2.2 βⅢ-tublin免疫荧光染色βⅢ-tublin是神经元的标记物之一，可反映新生神经元的数量。与假手术组相比，VD组和次声组大鼠在海马齿状回颗粒下区表达的βⅢ-tublin 显著增加（P＜0.05），表明VD 发生后在海马区会出现新生神经元；次声组大鼠在海马齿状回颗粒下区表达的βⅢ-tublin较VD组显著增加（P＜0.05），表明低声压次声可以增加海马区神经元的分化。见表2、图1。

表2 各组βⅢ-tublin累积光密度比较 （±s）Table 2 Comparison of IOD of βⅢ-tublin in each group（±s）

表2 各组βⅢ-tublin累积光密度比较 （±s）Table 2 Comparison of IOD of βⅢ-tublin in each group（±s）

组别假手术组痴呆组次声组IOD 864.01±62.51 1486.61±74.02 1677.64±73.89 F值P值146.302＜0.001

3 讨论

随着脑血管病发生率的增加，VD 患者逐渐增多，探索更多康复方法是VD 重要临床需求，物理因子作为一种有效方法，已用于神经疾病康复中，根据物理特性不同分为声疗、光疗、电疗、磁疗等，次声作为一种物理因子，是一种机械波，其频率与人体器官固有振动频率相当，故易产生人体共振［14］，从而被用于疾病的康复。本研究通过探讨低声压次声在VD中的作用，发现其可以改善VD 认知功能，并促进了海马区神经元的生长。

血管闭塞导致持续性全脑低灌注可引起神经元发生凋亡，脑实质萎缩，造成隐性脑损伤［14］。脑血管损伤后内源性神经干细胞的增殖和分化参与形成新的神经线路，从而起到修复神经功能的作用［16-17］。有研究在对SD大鼠的实验中也得到类似的结论［18］，而且被逆转录病毒标记的新生神经元能够有效发挥功能［8，19］。记忆的形成与海马结构密切相关，有研究观察到海马依赖型记忆任务执行效果的提高与海马神经发生增加有关［20-22］，提示促进神经发生能够改善血管性痴呆患者的记忆力。但内源性的神经发生非常有限［23-24］，若同时能够配合有效的外源性手段，可提高神经修复的效果。研究发现暴露于16 Hz 次声的大鼠海马中nestin 蛋白表达明显增加，提示次声可以刺激大鼠海马内源性干细胞增殖［25］。本实验组前期研究发现对局灶性缺血大鼠进行低声压次声干预60 min/d，能改善其认知功能，并观察到在干预后的第7 天，就有内源性神经干细胞增殖增加的表现。在神经发生过程中，分化是其中重要且决定性的一步［26］，βⅢ-tublin（Tuj-1）在齿状回新生神经元中表达［27］，被用作成年神经发生过程中新生神经元的特异性标记物［28-30］。

本研究显示，分步双侧颈总动脉闭塞模型建立后第7 天，大鼠即可出现记忆力下降的表现，而经过低声压次声干预的模型大鼠与未经干预的模型大鼠相比，其记忆力损害得到一定的改善，提示低声压次声对血管性痴呆大鼠的认知功能能起到正向作用。同时从免疫荧光染色的结果中可以看出，持续脑灌注减低后大鼠海马齿状回颗粒下区的βⅢ-tublin 表达增加，提示内源性神经干细胞分化增加，而低声压次声可以进一步促进这一过程的发生。但本实验同时存在一定局限性，只观察了术后7 d 的变化，而没有进行长期干预和动态观察，下一步可继续完善和补充这方面的研究。

低声压次声对血管性痴呆有正向影响，这可能与促进内源性神经干细胞分化、改善海马区神经元功能有关，可作为VD临床康复的一种潜在治疗方法。