生物法调控右旋糖酐分子量的研究进展

相萍萍

（上海健康医学院附属卫生学校（上海健康护理职业学院（筹）），上海 200237）

右旋糖酐（Dextran）是一种微生物多糖，分子式为(C6H10O5)n，是由α-D-葡萄糖基聚合而成的高分子量同多糖，因为右旋糖酐聚合度的差别，所获得的右旋糖酐的分子量也不尽相同，不同分子量的右旋糖酐在食品行业有不同的应用。重均分子量在1×106～2×106的高分子量右旋糖酐可以作为食品添加剂使用，添加到面包中可增加柔软度、增大体积、改善面包的质地[1]；还可以用于果糖糖浆以及糖果中阻止蔗糖结晶[2]。重均分子量在1×105～1×106的右旋糖酐可用作糕点和饮料中的增稠剂、保湿剂和乳化剂等[3]；重均分子量小的右旋糖酐还可以作为益生元，作为人类和动物食品的营养添加剂[4]。传统自然发酵法生产的右旋糖酐不仅黏度大，而且分子量太高，为了得到特定分子量的右旋糖酐，需要将分子量高的右旋糖酐进行调控降解。本文综述了生物法调控右旋糖酐分子量的研究进展。

1 发酵法

合成右旋糖酐所用的菌株主要是明串珠菌和链球菌，所选择使用的菌株不同，合成的右旋糖酐的分子结构也有所差异。肠膜明串珠菌是当前合成右旋糖酐最常用的菌株。右旋糖酐主要是以蔗糖为底物，经肠膜明串珠菌发酵而合成，合成原理为肠膜明串珠菌分泌合成酶右旋糖酐蔗糖酶到细胞外，右旋糖酐蔗糖酶会进一步催化蔗糖生成D-葡萄糖基，并将生成的D-葡萄糖基转移到糖链上聚合形成分子量不同的右旋糖酐。

1.1 单一菌株发酵法

传统的单一游离菌株发酵法是通过优化培养基，控制反应条件如底物（蔗糖）浓度、接种量、发酵时间等合成一些中小分子量的右旋糖酐。但是这种方法的合成反应终体系的黏度较大，很难实现右旋糖酐的分离纯化，且右旋糖酐的产量及质量的稳定性较差。此外，发酵培养基如蛋白胨、牛肉膏、无机盐等可能未反应完全，体系中会有部分残留，导致杂质较多，且发酵时间较长，目标产物得率较低。

有文献报道[5]，游离菌产生的右旋糖酐的分子量更接近于蓝色葡聚糖的分子量（200 万），远大于固定化菌生成的右旋糖酐的分子量。QADER 等[6]利用海藻酸钙固定化菌发酵生产右旋糖酐，通过对右旋糖酐分子量及分子量分布的研究发现，固定化菌产生的右旋糖酐的相对分子质量为50 000。王清等[7]调控发酵培养基中碳源与氮源的含量发现，当培养基中其他条件不变时，增大碳源以及氮源的含量，合成的右旋糖酐分子量（百万数量级）增大，因此可以通过适当调整碳源与氮源的含量调控右旋糖酐的分子量。

采用固定化微生物技术，利用化学或物理手段将发酵生产右旋糖酐的菌株固定在一块特定的微小区域内或附着于某一块载体上进行固定化，可以得到固定化菌。固定化菌发酵法对右旋糖酐分子量控制比游离菌发酵法更显著，固定化菌的保存时间相对较长，并且对外界环境的耐受能力强，且固定化菌可重复使用。但是，固定化后的菌体活性下降，发酵生成的大分子右旋糖酐会存在固定化小球内或依附于小球表面，黏度较大，容易和固定化菌缠绕在一起，从而堵塞固定化小球的孔径，使大分子右旋糖酐无法及时从固定化小球中扩散出去。大分子右旋糖酐在小球内不断堆积，最后使固定化小球溶胀破裂。

1.2 双菌株发酵法

双菌株发酵法生产特定分子量的右旋糖酐是通过在含蔗糖的发酵体系中加入两种菌种的种子发酵液，一种菌株能催化蔗糖生成右旋糖酐，另一种菌株能够产生分解酶分解大分子右旋糖酐，通过调控发酵工艺条件如发酵温度、时间、pH 值、两种菌株混合发酵时间、两种菌株种子发酵液的加入比例等，调控合成分子量不同的右旋糖酐，控制效果明显优于单菌株发酵法。

KIM 等[8]将肠膜明串珠菌与斯达式油脂酵母混合发酵，通过研究培养基成分、两种菌株的种子培养液的加入比例、pH 值以及温度，在最优反应条件下合成了重均分子量为75 000 的右旋糖酐；廖安平等[9]通过向含蔗糖的培养基中加入肠膜明串珠菌以及圆弧青霉菌种子培养液混合发酵，调控发酵条件，最终获得产物中重均分子量为40 000 的右旋糖酐占80%。曹研研[10]研究了产分解酶右旋糖酐酶的棘孢青霉菌和右旋糖酐蔗糖酶的肠膜明串珠菌联合发酵对右旋糖酐分子量控制的影响，发现顺序发酵法对分子量的控制效果比混合发酵法好，右旋糖酐重均分子量能较好地控制在5 000 ～10 000。

相比传统的单一菌株发酵法，双菌株发酵体系中多加入了一种能产生右旋糖酐酶的菌株，右旋糖酐酶分解体系中右旋糖酐蔗糖酶合成的大分子右旋糖酐向目标分子量片段的药用右旋糖酐集中，此方法能较好地实现特定分子量右旋糖酐的定向合成，但反应体系较复杂，产物中仍有未反应完全的杂质，仍需要用有机试剂辅助分离。

2 酶法

酶法合成右旋糖酐需要先分离、提纯特定的细菌发酵分泌的合成右旋糖酐的合成酶 ——右旋糖酐蔗糖酶，然后利用右旋糖酐蔗糖酶合成右旋糖酐。相对于传统的微生物发酵法，酶法反应条件更加稳定，对右旋糖酐分子量的定向控制效果更显著。酶法合成的目标分子量右旋糖酐的均一度好、产物纯度高，且反应体系更加简单，没有发酵培养基等杂质的干扰，易于提取精制，更有利于进一步探索特定分子量右旋糖酐合成过程中的机理研究。酶法通常可以分为单酶法和双酶法。

2.1 单酶法

单酶法根据酶在体系中的状态可以分为游离酶法和固定化酶法。其中固定化酶是利用物理或化学方法，将游离酶封锁在固体材料或将其限制在某一区域内。王晓[11]和邹青松[12]分别利用固定化右旋糖酐蔗糖酶和游离右旋糖酐蔗糖酶，通过控制蔗糖浓度、发酵时间以及催化反应中右旋糖酐蔗糖酶的浓度等反应条件，调控发酵产物中不同分子量葡聚糖的含量。但是这两种方法生成的右旋糖酐重均分子量多集中在重均分子量大于1×106和重均分子量小于1×104的区域。

此外，与游离酶法相比较，固定化酶具有回收方便、相对稳定性高、可重复利用等优点，且采用固定化酶法可以减少体系的复杂程度，但是同时也存在一些弊端。①利用传统肠膜明串珠菌产生提取的右旋糖酐蔗糖酶的酶活相对较低，固定化后会使右旋糖酐蔗糖酶的酶活进一步损失；②固定化酶应用于大分子的合成，容易使固定化孔径阻塞，大分子不能及时排除，容易造成固定化小球溶胀破裂。

2.2 双酶法

在单合成酶右旋糖酐蔗糖酶体系中加入分解酶右旋糖酐酶，可以有效调控产物分子量的分布，大大提高中小分子量片段右旋糖酐的得率。右旋糖酐酶能专一性地水解α-1,6 糖苷键，将大分量的右旋糖酐水解成较小分子量的右旋糖酐。双酶法是在以蔗糖为底物的体系中加入两种酶：右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶协同催化合成右旋糖酐，右旋糖酐蔗糖酶不断合成大分子量的右旋糖酐，而右旋糖酐酶又可以对生成的大分子右旋糖酐进行降解，两种酶相互作用，对右旋糖酐分子量的控制效果显著。

GAN 等[13]以蔗糖为底物，在游离态右旋糖酐蔗糖酶催化生成右旋糖酐过程中，加入游离右旋糖酐酶，通过调控右旋糖酐酶的添加量以及添加时间，可以合成分子量不同的右旋糖酐，且产物中小分子量片段的右旋糖酐含量显著提高，但是仍然存在一些中等分子量的副产物。张义平[14]以蔗糖为底物，通过优化固定化右旋糖酐蔗糖酶和固定化右旋糖酐酶的双酶酶活比、底物浓度以及右旋糖酐蔗糖酶的总酶活量等反应条件制备右旋糖酐，获得平均相对分子质量小于10 万的右旋糖酐的比例达到99.95%，其占比远高于单酶法。

综上，双酶法对右旋糖酐分子量的控制效果好，小分子右旋糖酐得率高，且对环境友好。但由于未经修饰或改造的右旋糖酐蔗糖酶的酶活不高，且酶的活力与其催化能力密切相关，需要进一步构建工程菌或者驯化生产出右旋糖酐蔗糖酶酶活高的菌株，继续研究在高酶活作用下右旋糖酐定向合成作用机制。

3 结语

右旋糖酐是一种具有高附加值的多糖，在食品行业有广阔的市场前景。国内传统右旋糖酐的制备方法大多为先合成再水解，所得产品的分子量不易控制，分子量分布均一性差、含杂质多，且在化学降解过程容易破坏活性基团并引入有害物质。近年来，随着糖生物学研究的发展，很多研究者将制备特定分子量右旋糖酐方法聚焦于双酶合成法，通过调控双酶体系中底物浓度、右旋糖酐蔗糖酶加入量以及右旋糖酐蔗糖酶与右旋糖酐酶的双酶酶活比等，合成不同分子量的右旋糖酐。当前双酶法调控制备特定分子量的右旋糖酐条件温和、污染少、能耗低，目标分子量的右旋糖酐得率高，在保证产品质量的同时，降低了右旋糖酐生产成本，具有较好的应用前景。但是右旋糖酐蔗糖酶的酶活不高，且其分离及质控较难，相信随着酶工程、基因工程及分离纯化等技术的不断发展，将进一步提高特定分子量右旋糖酐的生产效率。