核酸适配体在食品兽药残留检测中的应用研究进展

李美芬，袁 月，马 瑞

（云南孚尔质量检验检测有限公司，云南昆明 650000）

随着人们生活水平不断提高，动物性产品的需求量也在不断增加[1]，兽药残留问题也越来越受重视。兽药残留主要包括抗生素类药物残留、激素类药物残留、抗病毒药物残留及抗寄生虫类药物残留等[2]。兽药残留可能引起过敏反应、增加细菌耐药性、扰乱肠道微生物菌群平衡、污染环境，甚至有致突变、致癌和致畸作用[3-5]。因此，必须高度重视动物性食品兽药残留的检测，切实加强食品安全监管。核酸探针法检测兽药残留是一种灵敏、快速、可靠的检测技术，目前已有越来越多的学者致力于该方法的探究。本文对核酸适配体在兽药残留检测中的应用研究进展进行简要介绍，期望为动物性食品兽药残留的监管和检测技术的深入研究提供一定的参考。

1 核酸适配体

核酸适配体（Aptamer，Apt）是一种通过体外配体指数富集系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）从人工构建的寡核苷酸文库中筛选出来的一段长度为20 ～60 nt 的单链寡核苷酸序列[6]。当Apt 与靶物质共存时，靶物质能够诱导Apt 由自由构象折叠成特有的三维空间结构，如茎环、发夹、G-四链体等[7-9]，并通过碱基对的堆积作用、静电作用[10]、氢键作用[11-12]、范德华力[13]等与靶物质特异性结合[14]，具有亲和力高、特异性强、靶分子范围广、易于制备和修饰、稳定性与可复性好等优势[15-17]。由此，核酸适配体在食品安全控制、分析化学、分子生物学以及环境检测等方面被广泛应用[18]。

获得亲和性高的单一适配体序列是Apt 技术的核心。SELEX 技术是目前最常用的Apt 筛选手段，通常是从一个1014～1015库容量的随机寡核苷酸文库中筛选与靶物质特异性结合且具有高亲和力的Apt，包括单链DNA 文库合成、单链RNA 文库制备、孵育、分离、转化、扩增、单链DNA 次级文库制备7 个步骤，经1 ～25 轮的筛选，即可能得到Apt[19-20]。

2 核酸适配体在食品中兽药残留检测的应用

凭借Apt 的优势，其在动物源食品的兽药残留检测发展快速。检测方法主要有纳米比色法、荧光分析法、化学发光分析法、电化学传感器检测法以及表面增强拉曼散射检测法。

2.1 纳米比色法

纳米比色法是基于纳米颗粒表面性质改变后，颜色会发生变化而建立的一种分析方法，主要有纳米金、纳米银等材料[21]。金纳米颗粒（Au Nanoparticles， AuNPs）具有高消光系数和良好的光学效应，近年来在分析检测领域受到相关人员的青睐[22]。纳米金比色法最早由Mirkin 等提出，主要分析方法有两类：①基于纳米材料的光学特性显色，依据靶物质触发AuNPs 聚集，导致波长红移，可通过紫外可见光谱或肉眼进行测定；②基于酶催化的显色，AuNPs 替代有机分子作为模拟酶催化反应中的底物，提高稳定性[23-25]。

张万方等[26]建立了一种纳米金核酸适配体杂交链式反应放大比色法快速检测动物源性食品中氨苄青霉素的残留量，通过Apt 与氨苄青霉素结合，引发适配体与发夹型DNA 探针的级联交叉互补放大效应，使其与AuNPs 表面的负电产生排斥作用，引起AuNPs 在高盐浓度下发生聚集，吸收光谱发生红移，该方法最低检测限可达10 nmol·L-1，检测回收率在92.30%～103.27%。钱成等[27]首次利用Apt 修饰的AuNPs 设计出逻辑开关组，通过Apt、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、三聚氰胺和环丙氨嗪控制AuNPs 的聚集和分散，同时快速检测牛奶中的三聚氰胺和环丙氨嗪，三聚氰胺的检出限为85 μg·L-1，环丙氨嗪的检出限为9.0 μg·L-1。ZHOU 等[28]利用Apt 与AuNPs 结合的比色法测定氟喹诺酮类药物氧氟沙星，线性范围为72.2 ～144.4 ng·L-1，检出限为1.2 ng·L-1，具有较高的特异性，成本低、操作简单。但由于纳米颗粒的聚集行为容易受温度、盐浓度等的影响，可能出现假阳性，导致检测体系不稳定，而使用模拟酶催化的比色法可以避免这种问题。例如HUANG 等[29]将核酸适配体特异性识别结合的特性与DNA zyme 功能化纳米探针催化显色原理相结合，建立了一种新型比色生物传感器，并将其用于检测奶粉中氯霉素残留，该实验将过氧化氢酶模拟物及适配体互补探针cDNA 与AuNPs 结合，构建新的纳米金探针，过氧化氢酶模拟物能催化H2O2，使3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（Tetramethylbenzidine TMB）氧化并产生比色信号，研究发现奶粉样品中加标回收率在92.0%～104.0%，相对标准偏差＜2.7%，检测信号大大增强。赵晨等[30]在采用AuNPs 比色法检测水产品中孔雀石绿的研究中，也建立了一种基于十六烷基三甲基溴化铵（Hexadecyl trimethyl ammonium BromideCTAB）抑制AuNPs 过氧化物模拟酶活性的可视化检测方法，检测范围在0.01 ～2.00 μmol·L-1，检出限为1.8 nmol·L-1；同时以磁性Fe3O4纳米颗粒（Fe3O4NPs）过氧化物模拟酶为催化剂，催化H2O2，氧化TMB 显示蓝色，根据DNA 适配体对Fe3O4NPs 模拟酶催化活性的抑制作用以及靶物质孔雀石绿与DNA 适配体结合的特异性，对靶物质的检测范围为0.1 ～1.0 μmol·L-1，检出限为9.5 nmol·L-1。对比发现，AuNPs 模拟酶催化法检出限更低，可用于物质的微量检测。

2.2 荧光分析法

荧光分析法是基于荧光物质在一定的激发波长下能够发射荧光的原理，通过检测荧光强度的变化，对测定物质进行定性或定量分析的一种方法，具有高灵敏度、低背景值和良好选择性等优点，在生命医学、化学、食品安全控制和环境检测等各种检测领域有广泛的应用[31]。Apt 本身不产生荧光，需要在反应体系中引入荧光基团、荧光淬灭剂、荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）和荧光内滤效应（Inner Filter Effect，IFE），引起荧光信号强度的变化。荧光基团包括荧光蛋白、荧光燃料、量子点、金属纳米粒子、碳点和纳米材料等具有荧光性能的有机物、无机物和纳米材料。许多纳米材料除了本身有荧光效应，也能作为荧光淬灭剂，还具有吸附单链核酸分子的能力，如氧化石墨烯（Graphene Oxide，GO）、纳米金颗粒、金属纳米颗粒（Metal Nanoparticles，MNPs）、上转换纳米颗粒（Up-Conversion Nanoparticles，UCNPs）、碳纳米管（Carbon Nanotubes，CNTs）、二氧化锰纳米片和各种纳米复合材料等。FRET 是当荧光供体和荧光受体的距离足够近时，荧光能量由供体向受体转移的现象[32]。

荧光分析法根据Apt 的标记分为标记型检测法和非标记型检测法两类。其中，标记型检测法具有灵敏度高、响应快速、可标记的荧光物质多等优点，具有多重和实时检测能力[33]，尤其引入新型纳米荧光材料时，荧光检测能力大大提升。如ZHANG等[34]用核壳上转换纳米粒子（Core-Shell Upconversion Nanoparticles，CSUNPs）作为荧光供体，GO 作为荧光受体，构建了一个基于适配体的CSUNPs-GO 荧光共振能量转移平台，以检测食品中恩诺沙星残留量，结果表明，溶液中恩诺沙星检测限为0.47 ng·mL-1，商业奶粉样品中的恩诺沙星检测限为1.59 ng·mL-1。宋亚宁等[35]用溶剂热法合成具有时间分辨特性的荧光纳米材料NaYF 4:Ce/Tb，并基于分子对接辅助设计培氟沙星（Pefloxacin，PEF）适配体的互补链，纳米金与发光纳米材料分别修饰在适配体、互补链上，通过碱基互补配对诱导2 种纳米材料间发生时间分辨荧光共振能量转移，构建生物传感PEF 的新型检测方法，在最佳条件下，测得牛奶中兽药残留PEF 加标回收率为73.81%～99.86%，检测限为0.15 μg·kg-1。LIU等[36]采用UCNPs 作为信号源和Apt 作为特定识别元件构建了检测恩诺沙星（Enrofloxacin，ENR）的荧光生物传感器，通过形成具有背景荧光信号的双链结构杂交探针（UCNPs-cDNA/Apt-Fe3O4），ENR 能够优先与Apt-Fe3O4特异性结合，破坏部分双链结构，释放出UCNPs-cDNA，降低荧光强度，再进行磁分离，检测杂交探针上未释放的UCNPs 的荧光强度，最后测得ENR 回收率为85.1%～98.5%，检出限为0.06 ng·mL-1，实现了高灵敏度检测。

虽然标记型检测方法的检测灵敏度更高，但是需要对探针进行化学合成标记，过程烦琐、耗时，非标记型检测模式则相对简便，无须使用化学试剂进行复杂的标记及最后的分离纯化[37]。刘若冰等[38]利用AccuBlue 荧光染料和Apt 的特点，建立一种基于Apt 快速检测动物源性食品中兽药残留恩诺沙星的非标记型荧光分析方法，结果表明，3 种动物源性食品（奶粉、虾肉、牛肉）加标回收率在76.54%～98.79%，方法的特异性、稳定性和重复性均良好。YAN 等[39]利用非标记氧氟沙星（Ofloxacin，OFL）的Apt、AuNPs 和罗丹明B 构建一种荧光生物传感器，Apt 包裹住AuNPs，在高浓度盐溶液中保持分散状态，能有效降低罗丹明B 的荧光强度；当OFL 与Apt 结合，脱离Apt 的AuNPs 形成聚集状态，聚合的AuNPs 无法猝灭罗丹明B 的荧光强度，使得荧光强度增强。该研究发现牛奶样品线性范围为7.2 ～108.3 ng·L-1，检出限为1.7 ng·L-1。许景月等[40]建立了一种荧光非标记型核酸适配体传感器，鸡肝样品中多巴胺测定回收率在91.4%～103.5%，相对偏差为0.9%～2.3%。刘宁宁等[41]利用非标记型传感器检测四环素，通过四环素Apt 序列进行优化，获得具有G-四链体形成双价Apt 序列，G-四链体结构可以激发硫代黄素T（ThT）荧光；当引入四环素后，四环素与Apt 序列结合，破坏G-四链体形成条件，ThT 荧光不能被有效激发，根据荧光变化作为输出信号，测得在10 ～1×103nmol·L-1线性关系良好，R2在0.99 以上，检测限为96 pmol·L-1，特异性强、耗时短、操作简便，可在20 min 内完成快速检测。

综合近几年相关学者对荧光生物传感器的研究，发现其具有灵敏度高、检测时间短、选择性好、干扰少等优点，但在低浓度的靶物质和实际样品的检测中仍存在重现性、精确度都较低的问题[42]，因此需要继续改进方法，以便实现更稳定、更灵敏的快速检测。

2.3 化学发光分析法

化学发光（Chemiluminescence，CL），指发光物质自身电子从激发态跃迁到基态所产生的发光，不需要使用外部光源或光学系统的化学反应，与荧光分析法相比可以有效避免光漂白效应，其检测信号由光子数决定，具有灵敏度高、仪器简单、校准范围宽、操作简便以及检测时间短等优点。如YAO 等[43]利用卡那霉素Apt、磁珠（Magnetic Bead，MBs）、AuNPs 构建了一种基于化学发光传感器检测卡那霉素的方法，将通过酰胺化的卡那霉素Apt 固定在MBs 上，Apt 互补探针cDNA 与AuNPs 结合，形成双链结构杂交探针（AuNPs-cDNA/Apt-MBs），当体系存在卡那霉素时，与Apt 结合，释放cDNA，富集的AuNPs 催化H2O2分解，鲁米诺被氧化后发出蓝光，研究发现该传感器检测限为0.035 nmol·L-1。HAO 等[44]利用碘苯酚（P-Iodophenol，PIP）构建了一个基于竞争的ABEI（乙基异鲁米诺）-H2O2-PIP 化学发光系统，用以检测牛奶样品中氯霉素残留。该系统先将生物素化的氯霉素适配体的磁性纳米粒子作为捕获探针，连有乙基异鲁米诺的金纳米结构作为信号探针，氯霉素与探针竞争性地与适配体结合，探针结合适配体后催化H2O2分解，氧化PIP 发光，该方法检测限为0.01 ng·mL-1，线性范围为0.01 ～0.20 μg·L-1。但由于化学发光分析法的信号探针制备相当费时耗力，发展受到限制，在动物性兽药残留的研究报道相对较少。

2.4 电化学传感器检测法

电化学适配体生物传感器是将核酸适配体固定在电极上，根据适配体与靶分子结合后引起电化学信号改变来实现靶分子测定的一种新型生物传感检测装置，具有成本低、特异性高、选择性强以及响应速度快等优点，在食品检测中越来越受到关注。

FENG 等[45]建立了一种可同时检测孔雀石绿和氯霉素的“双电势”新型电化学发光适配体传感器，通过对阳极修饰，连接鲁米诺-纳米金粒子，增强发光信号，结果发现，鱼类样品中孔雀石绿和氯霉素检测限分别为0.03 nmol·L-1和0.07 nmol·L-1。CHEN 等[46]采用电化学适配体传感器检测氯霉素时发现，通过利用纳米金属有机骨架（Nano Metal Organic Skeleton，NMOF）包封金属离子并固定cDNA 作为信号标签，得出该方法检测限低至0.19 pmol·L-1，同时线性范围为0.002 ～100.000 nmol·L-1。冯荣荣等[47]构建了两种电化学适配体生物传感器，一种将纳米金/石墨烯修饰到电极表面，灵敏度高，检测牛奶中卡那霉素时，线性范围为1.0 ～10 000.0 pmol·L-1，检出限为0.3 pmol·L-1；另一种基于核酸外切酶Ⅲ辅助循环放大技术设计了一种检测链霉素的核酸适配体电化学传感器，线性范围为0.1 ～1 000.0 pmol·L-1，检出限为0.03 pmol·L-1。ZHANG 等[48]研究电化学传感器测定牛奶样品中四环素时，根据适配体与目标分子结合前后构象变化引起的电信号变化，测得四环素线性范围在0.1 ～100.0 ng·mL-1，检出限为1 ng·mL-1。王赛等[49]在研究四环素测定时，利用核酸适配体作为识别元件，以四环素为靶分子，在新型集成式丝网印刷表面构建电化学传感器，通过DNA 自组装构建了四面体纳米结构，辅助适配体的定向固定，研究得出四环素线性范围为0.01 ～1 000.00 ng·mL-1，检测限为0.009 47 ng·mL-1，可实现微量、高灵敏度快速检测。赵亚男等[50]建立了电化学核酸适配体传感器用于检测四环素残留，以丝网印刷电极为基底电极，以具有电化学活性或催化活性的功能金属有机框架材料为信号介质和Apt 固定载体，构建了新型的免标记电化学传感器，实现了对草鱼、鲜虾、牛奶中四环素的测定。

2.5 表面增强拉曼散射检测法

表面增强拉曼散射（Surface-Enhanced Raman Scattering，SERS）是一种基于目标分析物分子吸附在经过特殊处理、具有纳米结构的金属材料（如金、银等）或非金属材料（半导体、石墨烯、量子点等）表面，产生极强的拉曼增强效应的分子振动光谱技术[2,51]。部分基底材料可以使拉曼散射强度增强1010～1015倍[52]。因此SERS 具有检测速度快、灵敏度高，能同时进行多重检测等独特的优势，近年来在食品安全分析领域受到关注。

核酸适配体SERS 技术是以Apt 修饰纳米颗粒，作为SERS 检测的探针，增强检测体系的特异性。YAN 等[53]在检测氯霉素的研究中以纳米金粒子为SERS 增强基底，制备了荧光染料Cy5-适配体-纳米金粒子识别探针，Cy5-适配体结合氯霉素形成茎环结构，与纳米金粒子分离，使得SERS 信号强度显著降低，实现了乳样品中氯霉素（Chloramphenicol，CAP）残留的高灵敏度检测，检测限为0.19 ng·L-1，回收率为96.6%～110.2%。WU 等[54]将四聚体金纳米粒子和土霉素-DNA 适配体及其3 个不同类型部分互补的寡核苷酸序列整合到SERS 基底上开发了一种适配体传感器，构建了对土霉素具有高亲和力的环境，以探测牛奶中的土霉素残留，结果发现检出限为0.003 ng·mL-1。JIANG 等[55]以Au@Ag NPs 为SERS活性基底，以硫醇为拉曼报告分子，采用银壳包裹的AuNPs-适配体作为识别探针，对未经处理的全脂牛奶中卡那霉素检出限可达0.90 pg·mL-1。JIANG 等[56]采用4-巯基苯甲酸作为拉曼报告分子，制备的Au@Ag NPs 新型适配体传感器用于牛奶中卡那霉素的检测，检出限为142 pg·mL-1。表明该活性基底在实际牛奶样品检测中具有很好的灵敏性和选择性。而FANG 等[57]采用Au NPs@Si 作为活性基底，构建SERS-适配体传感器对牛奶中的氯霉素残留进行检测，浓度降至1.5 pmol·L-1，灵敏度相对较低。费雪莲等[58]建立了同时检测牛奶中环丙氨嗪和三聚氰胺SERS-适配体传感器，适配体与环丙氨嗪和三聚氰胺结合后，控制纳米银在适配体表面还原，形成Cyr/Mel-DNA-Ag NPs复合物，以增强拉曼效应。结果发现，最适检测条件下，环丙氨嗪线性检测范围在0.10 ～0.65 mg·L-1，检测下限为13.6 μg·L-1；三聚氰胺线性检测范围在0 ～0.5 mg·L-1，检出限为43.5 ug·L-1，可为快速检测牛奶中兽药残留提供参考。总之，SERS 结合适配体检测动物性食品中的兽药残留应用广泛，检测效果好，将在兽药残留检测中有更好的发展前景。

3 结语

近年来，食品安全问题频发，影响了社会大众的身心健康和国民经济的良性发展，其中动物性食品中兽药残留给食品安全造成极大的威胁。基于核酸适配体检测动物性食品中兽药残留发展迅速，检测结果准确，且灵敏度高。但在高质量的适配体筛选、优质纳米材料的开发合成、检测体系的稳定性、信号增强放大方法的探究以及多目标检测系统的设计等方面还需重点研究。核酸适配体作为抗体替代识别探针，涉及多学科理论方法和技术手段，随着科学技术的进步以及检测体系的不断完善，相信该技术在动物食品兽药残留检测中的应用将会更加深入，发展前景良好。