CRISPR/Cas系统在感染性疾病诊断中的应用进展*

潘 兴,林永红,杨 柳,马 可 综述,于 霞△ 审校

1.重庆医科大学检验医学院,重庆 400016;2.电子科技大学医学院附属妇女儿童医院/成都市妇女儿童中心医院检验科,四川成都 610091

感染性疾病是各种病原微生物感染机体造成的疾病,如人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、新型冠状病毒(SARS-CoV-2)等。根据世界卫生组织(WHO)2019年全球死亡原因统计数据,全球范围内因感染病原体死亡人数达1 020万,占全部死亡病例的18%[1]。截至2022年4月,在全球快速传播的新型冠状病毒感染病例已超过5.04亿,死亡600万例[1]。快速、灵敏、特异的病原体检测方法是预防和控制感染性疾病暴发的重要保证[2]。根据WHO的标准,最理想的病原体检测方法应低成本、高灵敏度、特异性、即时和便携[3]。目前,常用的病原体检测方法包括:形态学检查、分离培养与鉴定、免疫学方法、实时荧光定量PCR(qPCR)、基因组测序方法、质谱法等。但这些方法存在检测周期长、操作复杂、依赖昂贵仪器等缺陷,极大地限制了其在感染性疾病中的应用。

规律间隔成簇短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas)系统是由细菌和古细菌在抵御病毒的过程中演化而来的适应性免疫系统[4-6]。当病毒感染细菌时会将病毒的DNA切下一部分并整合入CRISPR序列中,CRISPR基因可加工成靶向特定病毒DNA的小向导RNA(sgRNA),sgRNA随即指导Cas核酸酶蛋白对病毒DNA进行精准切割,从而起到清除外来物的作用[7-8]。理论上,通过改变sgRNA序列可定向识别切割任一核酸序列[9]。CRISPR/Cas系统最早被应用于基因编辑,随着人们对CRISPR/Cas系统的不断研究,发现了其在分子诊断领域的巨大前景。因此,本文针对CRISPR/Cas系统及其在感染性疾病诊断领域的应用进展进行综述。

1 CRISPR/Cas系统简介

1.1结构 CRISPR/Cas系统主要包括CRISPR基因和Cas基因2个部分。CRISPR基因包含位于上游的前导序列(leader)、重复序列(repeat)和间隔序列(spacers)。前导序列启动CRISPR基因转录,产生一个长度约为200 bp 的CRISPR RNA(即crRNA),富含AT碱基;有许多高度保守的重复序列,序列长度24～47 bp,平均长度32 bp,其中包括回文序列5～7 bp,可形成发卡结构;间隔序列分隔多个重复序列,是一系列长度相等的非重复序列,由病毒等外源DNA被细菌识别切割而整合入重复序列之间,长度为17～84 bp,平均长度为36 bp。Cas基因位于CRISPR基因的上游,被称为CRISPR的相关基因。Cas编码的Cas蛋白为一类核酸酶,在crRNA引导下识别并切割与crRNA互补的核酸片段。Cas基因也可以编码解旋酶、聚合酶、RNA结合酶等,这些酶参与了免疫过程并发挥免疫功能[8,10-11]。DELTCHEVA等[12]还发现了位于Cas基因上游的反式编码的CRISPR RNA(tracrRNA)。tracrRNA与crRNA通过碱基互补作用结合,从而靶向外源DNA并指导Cas蛋白发挥核酸酶水解作用[13]。

1.2分类 2011年,MAKAROVA等[14]提出了多元分类法,整合系统发育、基因序列和结构分析将CRISPR/Cas系统分成三大类:Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型(type Ⅰ～Ⅲ),即仅含有Cas3蛋白为Ⅰ型,仅含Cas9蛋白为Ⅱ型,以及含有Cas10蛋白为Ⅲ型,Ⅰ～Ⅲ都含有Cas1、Cas2。这是最早的CRISPR/Cas系统公认的分类方法。2015年,MAKAROVA等[15]利用PSSM矩阵库综合分析2 751个细菌与真菌的基因组数据,提出了Ⅳ型与Ⅴ型两个新型别,继而得出更广泛的分类方式,即将CRISPR/Cas系统分成两大类:第1类具有多重亚基crRNA效应子复合物,包含多个执行单一功能的Cas蛋白,而第2类效应子复合物的所有功能均由单一Cas蛋白执行,如Cas9蛋白。随后,MAKAROVA等[16]又丰富了CRISPR/Cas系统的分类,发现了33个亚型和靶向RNA切割的Ⅵ型[17]。最新的分类将已鉴定的CRISPR/Cas系统分为两大类,第1类包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型,标志性蛋白分别为Cas3、Cas10、Csf1,第2类包括Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ型,标志性蛋白为Cas9、Cas12a、Cas13[18]。每一型根据Cas蛋白的作用位点不同又可分为多种亚型。由于第2类CRISPR/Cas系统用单一、多功能Cas蛋白进行基因编辑,相较于第1类系统更为高效简单,因此一直是研究应用的热点。

2 工作原理

CRISPR/Cas系统是细菌对病毒入侵的免疫防御系统,其发挥功能的机制分为3个阶段:适应、表达、干扰[14-15]。在适应阶段,病毒DNA片段被剪切整合进CRISPR基因的间隔序列中,细菌便保留了对病毒的记忆性,以抵抗病毒的再次入侵。在表达阶段,CRISPR基因的前导序列启动一级转录,产生pre-crRNA,然后经过加工成熟处理,生成crRNA。在干扰阶段,crRNA能引导Cas蛋白识别目标DNA的前间区序列邻近序列(PAM)从而引起DNA双链断裂。

2.1CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9工作原理与免疫机制类似,不同在于crRNA还需与tracrRNA结合成sgRNA,sgRNA指导Cas9蛋白识别外源DNA的PAM序列使靶标序列解链,同时Cas9蛋白的HNH与RuvC-like结构域分别剪切crRNA互补链和非互补链[19]。DNA双链断裂(DSB)会启动修复机制包括非同源末端结合(NHEJ)与同源重组修复(HDR)[20]。因而改变sgRNA序列即可对任何DNA进行基因编辑。

2.2CRISPR/Cas12 CRISPR/Cas12包括Cas12a和Cas12b。以Cas12a为例,对比CRISPR/Cas9系统作用机制有以下不同:(1)不需tracrRNA帮助crRNA成熟和指导Cas蛋白识别切割靶标序列[21]。(2)Cas12a包含RuvC-like结构域与NuC结构域,不包含HNH结构域,仅RUvC结构域切割DNA双链即顺式切割[22]。(3)Cas12a具有反式切割活性,即非特异性DNA剪切活性,能将非靶标序列的任意单链DNA切割[23]。利用Cas12a的反式切割活性,通过在反应系统中加入信号标记的单链DNA从而实现特异基因的检测。

2.3CRISPR/Cas13 CRISPR/Cas13包括Cas13a、Cas13b、Cas13c和Cas13d。Cas13特点在于它可以识别剪切单链RNA。Cas13a由REC结构域与NUC结构域组成,为双瓣叶形的球状蛋白结构。REC结构域包含NTD和Helical-1结构域,其中NUC结构域包括两个HEPN结构域、Helical-2结构域以及连接两个HEPN结构域的连接结构域(Helical-3)[24-25]。Helical-1负责切割crRNA前体使之成熟。HEPN结构域识别靶标RNA的PFS位点(protospacer flanking sites),进而激活Cas13a蛋白RNA酶活性对靶标RNA顺式切割,在顺式切割后Cas13a还会对非靶标单链RNA进行反式切割[17,26]。

3 CRISPR/Cas系统在感染性疾病中的应用

3.1CRISPR/Cas9 将CRISPR/Cas9系统应用于感染性疾病检测的首次亮相是在2016年。2016年,PARDEE等[27]研发了一种能以单碱基分辨率检测寨卡病毒的纸基传感器,该检测系统将等温RNA扩增技术NASBA、toehold开关RNA传感器和CRISPR/Cas9系统相结合,根据NASBA反应扩增的双链DNA有无特异性PAM序列和sgRNA作用靶点,使Cas9对扩增产物产生不同切割活性。未被切割的DNA双链转录出长链RNA而激活传感器,从而使纸基上发生颜色变化。2018年,HUANG等[28]建立了一种基于CRISPR/Cas9系统的等温指数核酸扩增方法(CAS-EXPAR),扩增的引物由Cas9/sgRNA复合物对目标DNA序列定点剪切而产生,从而诱导扩增反应产生大量DNA,并采用qPCR进行检测。将其用于李斯特菌检测,灵敏度可达0.82 a mol/L级(阿摩尔每升级),且有识别单碱基错配的特异性。2020年,WANG等[29]结合CRISPR/Cas9系统与侧向横流技术,构建了新型的比色生物传感器CASLFA(CRISPR/Cas9-mediated lateral flow nucleic acid assay),该技术能够在1 h内对非洲猪瘟病毒进行检测。

除了利用Cas9的定点切割功能检测外,对于失去剪切能力但保留了结合能力的dCas9(nuclease-deactivated Cas9)也能很好地应用于病原体检测中。2017年,ZHANG等[30]利使用一对具有荧光素酶分离结构域的dCas9对两个靶向序列进行检测,当两个荧光素酶的分离结构域靠近时,会发生荧光素氧化反应产生可检测的荧光信号;GUK等[31]基于SYBR GREEN Ⅰ荧光染料开发了dCas9/sgRNA-SG Ⅰ DNA-FISH系统:dCas9/sgRNA复合物能够特异性识别靶标序列并形成三元复合物。由于dCas9蛋白带有His标签,所以利用anti-His磁珠可以将三元复合物分离,最后加入SYBR GREEN Ⅰ与体系中的靶标DNA结合实现检测。该方法成功用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测。2019年,REZA等[32]联合dCas9和石墨烯晶体管建立了高灵敏度的便携电化学生物传感器。将dCas9连接到石墨烯晶体管上,当dCas9识别并结合靶向序列会引起石墨烯电导率发生变化,从而可检测到电信号。这种方法无需扩增,灵敏度达1.7 fmol/L级(飞摩尔每升级)。此外,KUMAR等[33]利用了一种能与特定SARS-CoV-2突变株中核酸序列特异结合的Cas9蛋白(FnCas9),开发了用于诊断SARS-CoV-2感染的FELUDA(FnCas9 editor-linked uniform detection assay)平台。这种Cas9蛋白对靶标序列变化高度敏感,可利用侧向横流技术检测这种特定的Cas9蛋白,从而检测SARS-CoV-2。

3.2CRISPR/Cas12 最先应用于感染性疾病核酸检测中的是Cas12a,最早于2015年被张锋团队发现,又称为Cpf1[34]。由于Cas12a既能顺式切割靶标双链DNA(dsDNA),又能反式切割非靶标单链DNA(ssDNA),因此在感染性疾病核酸检测方面较Cas9应用更为广泛。2018年,CHEN等[35]将重组酶聚合酶扩增(RPA)与CRISPR/Cas12系统结合,建立了灵敏准确的病原体检测系统DETECTR(DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter),成功应用于人乳头状病毒(HPV)的诊断,灵敏度达amol/L级。该检测系统在反应体系中引入分子探针(一端连接荧光基团,一端连接猝灭基团),Cas12a识别靶标序列后产生非特异性切割活性,荧光基团与猝灭基团分离从而释放荧光信号。RPA使荧光信号累积从而提高检测灵敏度。2020年,DETECTR被用于基于CRISPR/Cas12的SARS-CoV-2检测,结合侧向横流技术能快速(30～40 min)检测临床样本中SARS-CoV-2[36]。2018年,LI等[37]将检测系统DETECTR中的RPA扩增步骤替换成传统的PCR研发了快速、有效的核酸检测平台HOLMES(one hour low-cost multipurpose highly efficient system),其可用于检测伪狂犬病病毒(DNA病毒)和日本乙型脑炎病毒(RNA病毒)。2019年,YAN等[38]开发出基于Cas12b和环介导等温扩增技术(LAMP)的检测平台HOLMESv2。该检测系统利用了一种来自酸土环脂芽孢杆菌的Cas12b(AacCas12b),这种Cas12b在48 ℃有最佳的DNA切割活性,由于Cas12b和LAMP的工作温度相同,可将LAMP扩增和Cas12b反式切割整合到一个恒温的一步系统中,从而为检测提供了方便,同时还能有效消除LAMP反应产生的非特异性信号,提高灵敏度。2022年,BHATT等[39]联合逆转录-LAMP(RT-LAMP)、CRISPR/Cas12系统以及侧向横流技术,建立了一种无需RNA提取步骤并可直观诊断SARS-CoV-2感染的方法,称为CLEVER assay。该诊断技术在保证灵敏度、特异性及速度的情况下,还大大简化了检验程序、降低检测成本,适合于资源有限的地区进行大规模SARS-CoV-2感染检测。

为避免移液和开盖过程造成的污染,SUN等[40]提出一管化的CRISPR/Cas12系统检测系统OR-DETECTR。在此检测系统中,将RPA扩增体系与Cas12a混合物在一个管内进行反应,2个体系采用物理隔离方式分开,RPA扩增后通过瞬时离心混合,RPA产物即可被Cas12a识别切割产生荧光信号。利用免疫层析试纸条可视化检测反应产物可以简化仪器,使结果呈现更为直观[41-43]。若采用耐热的AacCas12b和LAMP扩增方法,即可一管化混合反应且无需物理隔离和离心混合。JOUNG等[44]便是基于这一原理提出了STOPCovid一步化检测的方法,应用于SARS-CoV-2感染的检测。该检测方法使用了AacCas12b和LAMP共同反应缓冲液,将RT-LAMP扩增和切割反应混合于一管进行,并采用磁珠提取RNA,去掉了乙醇提取和洗脱的过程,简化了检测步骤。除了借助仪器监测荧光信号,还可直接肉眼观察。2023年,CHEN等[45]设计了一种基于CRISPR/Cas的便携式猴痘病毒裸眼检测系统。该系统利用了CRISPR/Cas12的高选择性和RPA的等温核酸扩增能力,放大荧光信号,随即用LED照射反应产物可肉眼观察颜色变化,使用智能手机捕捉图像获得颜色随时间的变化。

上述研究均以荧光作为信号输出,此外,电化学传感作为一种高灵敏度的信号传导装置已被应用于基于CRISPR/Cas12的核酸检测中,使得检测系统不需要通过扩增来增加反应灵敏度。DAI等[46]建立了一种名为E-CRISPR的电化学生物传感器。在该方法中,亚甲基蓝修饰的ssDNA通过硫醇键固定在金电极上,作为电化学报告探针。当Cas12a识别靶标序列激活反式切割活性,剪切电化学报告探针,从而MB从金电极表面释放并产生峰值电流改变。因此可通过电信号检测靶标序列的有无。该方法用于HPV的无扩增直接检测,灵敏度为50 pmol/L级(皮摩尔每升级)。随后,ZHANG等[47]对此进行了改善,用发夹状DNA代替了线性ssDNA,这种独特的结构使得MB与电极之间距离更近,从而提高了峰值电流,同时还提高了Cas12a的切割效率,极大地提高了检测灵敏度。

3.3CRISPR/Cas13 Cas13与靶标序列识别结合后会激活对非靶标ssRNA反式切割的活性。2017年,张锋团队利用该特性开发了SHERLOCK技术,该方法先将底物DNA或RNA经重组酶聚合酶扩增(RPA)或逆转录-RPA(RT-RPA),提高检测灵敏度,再利用T7转录酶将扩增后的DNA转录为可被Cas13靶向识别的RNA,并与LwaCas13、crRNA反应液混合[48]。当crRNA引导LwaCas13识别切割靶标后,激活LwaCas13对非靶标ssRNA剪切活性,非靶标ssRNA两端的荧光基团和猝灭基团因此分离,从而释放荧光信号。SHERLOCK技术整合了等温扩增技术RPA和Cas13的检测能力,将反应灵敏度提升至amol/L级。该团队利用SHERLOCK成功检测寨卡病毒和登革热病毒。后来,多项研究以SHERLOCK技术为基础将CRISPR/Cas13a应用于HIV、禽流感病毒、SARS-CoV-2、HBV、非洲猪瘟病毒的核酸检测技术中[49-53]。2018年,张锋团队通过对SHERLOCK技术进行改进,推出了SHERLOCKv2[43],将Csm6与Cas13串联使用使反应灵敏度增加了3.5倍。Csm6是Ⅲ型CRISPR/Cas系统中的二聚体RNA内切核酸酶,基于其在信号放大中的内源性功能,能提高RNA检测的灵敏度。此外,还根据不同Cas13剪切活性设计具有不同序列、带有不同荧光基团的非靶标分子,从而实现多通道检测平台。2021年,LIU等[54]也将Csm6和Cas13a联用,研发了快速串联集成核酸酶检测(FIND-IT)的无扩增技术。由于减少了核酸扩增步骤大大加快了检测速度,能够快速诊断SARS-CoV-2(约20 min)且不牺牲测试的灵敏度,极大适用于感染性疾病的即时诊断。为优化RNA提取步骤以适应现场快速检测,MYHRVOLD等[55]将HUDSON(指一种通过加热或化学还原反应来溶解病毒颗粒和灭活RNA酶的方法)与SHERLOCK结合,建立了一种能直接从体液中检测病毒的方法。经HUDSON处理过的尿液或唾液可以直接进行RPA反应,无需提取纯化RNA。该方法能在2 h内检测出低于单拷贝(1 copy/μL)的寨卡病毒和登革热病毒。ARIZTI-SANZ等[56]对HUDSON进行优化,缩短了HUDSON的孵育时间,并利用智能手机摄像头实时监测管内荧光读数变化,避免了反复开盖造成的污染,开发了SHINE(streamlined high lighting of infections to navigate epidemics)检测系统。该检测方法可在10 min内快速灭活鼻咽拭子和唾液中的SARS-CoV-2,检测时间缩短到50 min,极大地提高了诊断能力。

类似于基于CRISPR/Cas12b的STOPCovid检测方法,MAHAS等[57]发现了一种来自盲肠热梭状芽孢杆菌的Cas13a(TccCas13a),这种耐热Cas13a与LAMP的工作温度相同,能于一管混合反应,因此建立了基于CRISPR/Cas13a检测SARS-CoV-2的一管化系统,称为OPTIMA-dx。若采用侧向横流读取荧光信号,必须打开反应管读数增加了交叉污染的概率。而该方法用便携式荧光观察仪代替侧向横流读数,智能手机实时读取和收集检测结果,整个检测过程全封闭无需开盖,实现了一体化检测病毒的模式。

微流控技术具有小型化、集成化和自动化的优点[58]。微流控技术与CRISPR系统的结合可以弥补基于CRISPR/Cas系统的核酸检测技术的缺陷,在病原体的诊断上具有巨大前景。QIN等[59]将CRISPR/Cas13a与微流控技术结合,建立了一种用于检测埃博拉RNA的自动化POC系统。该检测系统不需要核酸扩增,能同时进行数十个样本中埃博拉病毒的检测,5 min内检测限可达20 PFU/mL(PFU为空斑形成单位,PFU/mL为感染性滴度的单位)。ACKERMAN等[60]将微孔阵列芯片与CRISPR/Cas13a结合,开发了一种用于核酸多重检测的组合阵列系统(CARMEN)。该平台能够实现169种人类病毒的区分、甲型流感病毒的全面分型以及数十种HIV耐药突变的多重鉴定。受此启发,WELCH等[61]设计了一种用于高通量检测SARS-CoV-2及其他呼吸道病毒的检测系统,称为mCARMEN。mCARMEN增加了监控功能,能在1 d内测试数百个样本,能够快速检测包括SARS-CoV-2在内的21种呼吸道病毒。

4 小结与展望

现有的病原体检测方法大多操作复杂、耗时长且依赖昂贵的仪器设备,而CRISPR/Cas系统作为一种强大的基因编辑手段,能结合核酸扩增技术PCR、RPA、LAMP等,将核酸剪切或结合的过程转换为荧光、比色、电子等信号,并通过荧光检测仪、LFAD、肉眼、智能手机、电化学传感器、微流控芯片等读取从而检测病原体核酸。基于CRISPR/Cas系统设计开发的新型核酸检测技术具有突出优势:(1)检测周期短、一般2 h内可出结果;(2)灵敏度高,可实现amol/L级的检测,而传统PCR检测限为fmol/L级;(3)特异性强、能识别单碱基变化;(4)简单便携、不依赖昂贵的仪器和实验环境,更适用于床旁即时检测(POCT);(5)结果读取方便,通过荧光检测和肉眼读取结果。这些优势必将使得CRISPR/Cas检测技术在感染性疾病检测领域中发挥重要作用。

然而,CRISPR诊断工具仍然存在一些局限性:(1)样本中靶标浓度低,大多需要借助核酸扩增技术,使检测步骤烦琐,易造成污染,同时容易出现假阳性或假阴性的检测结果;(2)CRISPR/Cas技术的脱靶效应会造成假阴性的检测结果。在sgRNA的引导下Cas蛋白识别靶标序列过程中,可能会与非靶点核酸序列部分错配,造成错误切割;(3)目前大多数基于CRISPR/Cas系统建立的分子诊断平台还难以实现对多种病原体的高通量检测;(4)需要根据已知病原体的基因序列来设计crRNA,难以应对新出现或发生突变的病原体的检测;(5)sgRNA精准识别靶标序列依赖于PAM序列,且不同类型Cas蛋白识别不同PAM序列。这一特性虽然增加了CRISPR/Cas系统的特异性,但也限制了靶标区域的选择,同时降低了CRISPR/Cas系统的灵活性。

基于以上挑战,未来可在如下方面进行改进。(1)简化CRISPR/Cas诊断程序:采用一系列措施减少工作步骤,如优化或免除核酸提取及扩增,可通过使用更高灵敏度的检测设备如电化学传感器,结合免疫磁富集、微流控富集技术,开发对靶标序列变化高敏感的新型Cas蛋白,丰富CRISPR工具箱等手段。目前虽然已出现了基于CRISPR/Cas系统无需扩增的核酸检测技术,但仍存在灵敏度偏低的问题,因此未来还需对体系进一步改善。此外,可引入智能设备实时监测结果,数据自动上传,避免开盖降低污染,同时使检测结果读取简便直接。(2)降低CRISPR/Cas系统脱靶效应和PAM约束:Cas 蛋白作为 CRISPR/Cas 系统的核心元件之一,其结构和作用机制在很大程度上决定了该系统的功能走向,因此可对Cas蛋白进行工程化改造,设计高靶向特异性和更宽范围的PAM识别序列以优化提升CRISPR/Cas系统。对crRNA优化设计可提高Cas蛋白特异性,进而减少脱靶效应。除了改造CRISPR/Cas系统自身之外,还可以通过外源蛋白结构域的引入。(3)设计多通道或高通量检测系统:新材料、新技术与CRISPR系统的结合是实现高通量检测的关键。CARMEN平台即是将微孔阵列芯片与CRISPR/Cas13a结合成功用于核酸多重检测。微流控技术以其低成本、小体积和自动化的优势在高通量检测领域引起广泛关注。将微流控技术与新兴材料,如纳米材料、水凝胶相结合,将会使CRISPR/Cas检测平台向高通量、便携化、自动化发展的重要研究方向发展。尽管CRISPR/Cas技术存在一定局限,但其无可比拟的优势仍使其在核酸检测领域拥有革命性的应用潜力,相信随着科学家的不断研究和技术的不断发展,CRISPR/Cas技术有望能成为感染性疾病诊断领域的利器。