怀山药硒多糖的制备及其对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

2023-11-22连伟帅许美娟袁晓晴

安徽农业大学学报 2023年5期

关键词：糖苷酶山药抑制率

胡燕，连伟帅，许美娟，袁晓晴

怀山药硒多糖的制备及其对-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

胡燕，连伟帅，许美娟，袁晓晴

(河南牧业经济学院食品与生物工程学院，郑州 450046)

怀山药；硒多糖；制备；-葡萄糖苷酶抑制率

糖尿病已经成为严重威胁人类健康的疾病之一。Ⅱ型糖尿病的主要危害表现为餐后高血糖引起的并发症，所以控制高血糖水平成为防治糖尿病的最首要目标。糖尿病人血糖的升高与糖尿病关键酶α-葡萄糖苷酶的作用密切相关，因而α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选已成为筛选治疗Ⅱ型糖尿病药物的热点[1]。现临床使用的α-葡萄糖苷酶抑制剂（阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇）都存在不同程度的不良反应，容易引起腹胀、腹痛和腹泻等[2]，因此筛选安全有效的天然葡萄糖苷酶抑制剂成为当下研究的热点方向。

现代药理学研究表明山药多糖（CYP）具有显著的降血糖、增强免疫、抗突变、抗肿瘤等作用[3]。段伟萍等[4]初步评价了不同产地山药多糖-葡萄糖苷酶抑制活性。结果发现，不同产地山药多糖均对葡萄糖苷酶活性具有抑制作用，并随着多糖浓度的提高，其抑制率随之提高。有研究显示，天然多糖的活性往往不够高，限制了它们的应用，而这种缺陷往往可以通过分子修饰的方法弥补[5-6]。硒化改性是常见的分子修饰方法之一。多糖分子中含有醛基、羟基、酮基等多种功能性活性基团，可以与其他物质发生反应。硒可以通过化学反应被接枝到多糖分子上[7]。硒多糖是一种重要的有机硒化合物，具有比单独的硒或多糖更高的生物活性，其生物活性涉及抗氧化、降血糖、增强免疫力、抗癌、抗金属中毒等多方面[8-10]。有研究表明，山药硒多糖对超氧阴离子自由基清除能力、对羟基自由基的清除能力和对DPPH的清除能力都比山药多糖强[11]，但是有关山药硒多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究目前还鲜见报道。本文采用HNO3-Na2SeO3法对CYP进行硒化修饰，研究Se-CYP的制备及其抑制α-葡萄糖苷酶活性，为筛选和制备高活性且绿色安全的α-葡萄糖苷酶抑制剂提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试材与试剂

新鲜怀山药，购买自河南省焦作市温县山药种植基地。纤维素酶（1 U·g-1）、α-淀粉酶 (4 000 U·g-1)、α-葡萄糖苷酶（50 U·mg-1）、阿卡波糖、4-硝基苯-α-D吡楠葡萄糖苷均为BR，麦克林试剂。NaOH、HCl等其他化学试剂均为AR，国药化学试剂。

1.2 仪器

BlueStarB 紫外可见分光光度计，北京莱伯泰科仪器股份有限公司；F98荧光分光光度计，上海棱光仪器有限公司；WQF-530 红外光谱仪，北京北分瑞利分析仪器有限公司；DSX-9243B51电热鼓风干燥箱，上海福玛实验设备有限公司；JW-2018H高速离心机，安徽嘉文仪器装备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CYP的提取和纯化方法参照周丽等[12]的方法并稍加修改。新鲜山药去皮，洗净，切成均匀薄片，冷冻干燥，粉碎过筛备用。准确称取山药粉5 g，添加山药粉质量0.2% 的纤维素酶和1% 的α-淀粉酶，加入100 mL 的蒸馏水并调节 pH 至 4 ～ 5，在设定温度45 ℃ 的水浴锅中提取3 h时间后，上清液在4 500 r·min-1条件下离心20 min，去沉淀留上清液浓缩，加入4倍的95%乙醇于4 ℃的冰箱中过夜后离心，沉淀即为CYP。称取5 g的CYP溶于纯水中，将氯仿和正丁醇按 V（氯仿）:（正丁醇）= 5:1混合，即 Sevage 试剂。加入1 mL Sevage 试剂，混合物剧烈振荡均匀后离心，倾出上清液，重复操作到中间层无变性蛋白为止，上清液浓缩干燥得精制的CYP。

1.3.2 Se-CYP的制备方法参照张春岭等[13]的方法并稍加修改。将100 mg CYP与20 mL一定浓度的HNO3混合，搅拌使其完全溶解，然后加入一定量的Na2SeO3，在一定的温度和时间下进行反应。反应完成后，冷却至25 ℃左右，调整pH值至5 ～ 6，然后3 000 r·min-1离心10 min。上清液用1 kDa超滤膜透析至检测不到游离Na2SeO3存在。游离Na2SeO3用抗坏血酸法进行检测[14]。将多糖溶液浓缩，冷冻干燥即得到Se-CYP。

1.3.3 单因素试验设计 1） CYP与Na2SeO3质量比对Se-CYP硒含量和-葡萄糖苷酶抑制率的影响。固定硝酸浓度、反应时间和反应温度不变，调整CYP与Na2SeO3的比例分别为2:8、4:6、5:5、6:4和8:2，按照1.3.2的方法制备Se-CYP，并对其硒含量和-葡萄糖苷酶抑制率进行测定。

2）硝酸浓度对Se-CYP硒含量和-葡萄糖苷酶抑制率的影响。固定CYP与Na2SeO3质量比、反应时间和反应温度不变，调整硝酸浓度分别为0.6%、0.8%、1.0%、1.2%和1.4%，按照1.3.2的方法制备Se-CYP，并对其硒含量和-葡萄糖苷酶抑制率进行测定。

3）反应时间对Se-CYP硒含量和-葡萄糖苷酶抑制率的影响。固定CYP与Na2SeO3质量比、硝酸浓度和反应温度不变，调整反应时间分别为2.0、4.0、6.0、8.0 和10.0 h，按照1.3.2的方法制备Se-CYP，并对其硒含量和-葡萄糖苷酶抑制率进行测定。

4）反应温度对Se-CYP硒含量和-葡萄糖苷酶抑制率的影响。固定CYP与Na2SeO3质量比、硝酸浓度和反应时间不变，调整反应温度分别为50、60、70、80和90 ℃，按照1.3.2的方法制备Se-CYP，并对其硒含量和α-葡萄糖苷酶抑制率进行测定。

1.3.4 正交试验设计以CYP与Na2SeO3质量比、硝酸浓度、反应时间和反应温度为自变量，反应产物的硒含量和-葡萄糖苷酶抑制率为指标，设计四因素三水平L9（34）正交试验。正交试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素及水平

1.3.5 硒含量的测定参照王莲芳等[15]的方法，利用3, 3'-二氨基联苯胺比色法测定硒含量。

1）硒标准溶液的配制。准确称取Na2SeO30.547 5 g，用蒸馏水溶解定容至250 mL，制备硒含量为1 g·L-1的储备液。临用时稀释为1 mg·kg-1。

2）消化液的配制。称取2.4 g硫酸铜和36 g硫酸钾，缓慢加入120 mL硫酸，混匀备用。

3）样品处理。取1 g样品至15 mL的离心管中，加入5 mL的消化液，低温消化至溶液绿色透明。冷却后，将消化液转移至50 mL的烧杯中，将离心管内剩余的样品溶液冲洗干净，并一起倒入烧杯中，用1 mol·L-1NaOH调定pH值至7左右，用蒸馏水定容至100 mL容量瓶中检测。

4）标准曲线的测定。用移液枪准确吸取0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mL硒标准溶液至125 mL的分液漏斗中，加入蒸馏水至40 mL，用1 mol·L-1HCl溶液调至pH为2 ～ 3，再加入5% EDTA-2Na 溶液，再加入0.5% 的3, 3'-二氨基联苯胺溶液2 mL，摇匀备用。在黑暗中反应40 min，然后取出并用1 mol·L-1NaOH 将pH调至7左右后，加入10 mL甲苯，用力摇晃2 min使分层，最后取出甲苯层，在分光光度计420 nm波长处测量吸光度值。以硒含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。得到回归方程=0.011+ 0.000 2，2= 0.999 1，线性关系良好。

5）样品中硒含量的测定。用移液器准确吸取1 mL消化后的样品于125 mL分液漏斗中，按照上述标准曲线的测定步骤进行操作。硒含量（μg·g-1）按照公式（1）进行计算。

=/（1）

式（1）中：为从标准曲线中查得的硒含量（μg·g-1）；为测定时的样品体积占定容后总的样品体积分数（%）；为称取的样品质量（g）。

1.3.6 α-葡萄糖苷酶抑制率的测定根据庞小一等[16]的方法，在10 mL容量瓶中加入6 units β-葡萄糖苷酶0.2 mL，15 mg·mL-1的山药多糖溶液0.2 mL摇匀，置于37 ℃水浴中保温25 min。分别加入2 mmol·L-1PNPG溶液0.1 mL后，摇匀，置37 ℃水浴中保温15 min，取出冷却后，分别加入0.5 mol·L-1Na2CO3溶液1 mL，用纯水定容。分别于405 nm波长下测定吸光度A。用等量的纯水替代山药多糖溶液作为空白组，其吸光度为A。其中，α-葡萄糖苷酶抑制率记为(%)，按照式（2）进行计算：

1.3.7 傅里叶红外分析采用邝小贤等[17]的KBr压片法：准确称取2 mg的怀山药硒多糖与200 mg干燥的KBr研磨使其混合均匀，制成透明的薄片，最后用傅里叶红外光谱仪进行扫描。

1.3.8 数据处理试验结果以3次重复测定的平均值±标准偏差（SD）表示。利用OMNIC软件进行傅里叶变换红外光谱分析，利用Origin 8.5软件作图和进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 制备条件对Se-CYP硒含量和α-葡萄糖苷酶抑制率的影响

多糖与亚硒酸钠比例、硝酸浓度、反应时间和反应温度等主要的制备条件对Se-CYP硒含量和α-葡萄糖苷酶抑制率的影响见图1。从图1（a）中可以看出，Se-CYP中硒含量开始随CYP与Na2SeO3质量比的增加而增加，在CYP与Na2SeO3质量比为6:4时硒含量达最大值（9.61±0.44）mg·g-1，随后当CYP与Na2SeO3质量比继续增大时，硒含量随之下降。Se-CYP的-葡萄糖苷酶抑制率随着CYP与Na2SeO3质量比增大也呈现先增大后减小的趋势，在CYP与Na2SeO3质量比为6:4时达最大值（59.3±1.85）%。说明当CYP与Na2SeO3质量比为6:4时，二者反应较充分。

从图1（b）中可以看出，当HNO3浓度为1.2%时，Se-CYP硒含量最高，达（9.11±0.43）mg·g-1，α-葡萄糖苷酶抑制率也最高，达（56.5±1.24）%。而当HNO3浓度低于或高于1.2%时，反应产物的硒含量和-葡萄糖苷酶抑制率都相对较低。HNO3是该接枝反应的反应助剂，当HNO3浓度过低时，反应不能很好的发生；而当HNO3浓度过高时，可能不利于反应产物的稳定性。

从图1（c）中可以看出，Se-CYP中硒含量随着反应时间的延长而不断增大，但是当反应时间超过6 h后，硒含量增大的趋势趋于平缓，变化不大。在实验考察范围内，当反应时间达10 h时，反应产物硒含量达最大值（9.32±0.55）mg·g-1。而-葡萄糖苷酶抑制率随着反应时间的延长呈现先增大后减小的趋势，当反应时间为8 h时，其-葡萄糖苷酶抑制率达最大值（55.6±2.89）%。而当反应时间进一步延长时，其-葡萄糖苷酶抑制率表现为小幅度的下降。可能是因为当反应时间达到一定程度时，CYP和硒的鳌合已经达到饱和，继续高温则会导致Se-CYP的结构发生变化，致使活性遭受部分损失[18]。

从图1（d）中可以看出，Se-CYP中硒含量随着反应温度的升高而不断增大。在实验考察范围内，当反应温度为90 ℃时，反应产物硒含量达最大值（9.25±0.34）mg·g-1。而葡萄糖苷酶抑制率随着反应温度的升高呈现先增大后减小的趋势，当反应温度为80 ℃时，其-葡萄糖苷酶抑制率达最大值（55.8±2.06）%。当温度继续升高时，其-葡萄糖苷酶抑制率表现为小幅度下降。适当提高温度有利于硒化反应体系的动能增加，从而提高链反应速率，有利于硒化产物的形成[19]。但是，过高的温度有可能不利于反应产物的生物活性。

图1 多糖与亚硒酸钠比例（a）、硝酸浓度（b）、反应时间（c）和反应温度（d）对Se-CYP硒含量和α-葡萄糖苷酶抑制率的影响

Figure 1 Effects of ratio of CYP to Na2SeO3(a), HNO3concentration (b),reaction time (c) and reaction temperature (d) on selenium content and-glucosidase inhibition rate of Se-CYP

表2 Se-CYP制备的正交试验结果

2.2 正交试验结果及其分析

Se-CYP制备的正交试验结果（表2）表明，从反应产物的硒含量来看，制备工艺中各因素的重要性顺序为：A＞B＞D＞C，即CYP与Na2SeO3质量比＞硝酸浓度＞反应温度＞反应时间。最佳工艺为：A2B3C3D3，即CYP与Na2SeO3质量比为6:4，硝酸浓度为1.4%，反应时间为10 h，反应温度为90 ℃。按此最佳工艺制备的Se-CYP，平行3次，Se-CYP硒含量平均为（9.58±0.23）mg·g-1，高于正交试验中的最大值。从反应产物的α-葡萄糖苷酶抑制率来看，制备工艺中各因素的重要性顺序为：A＞B＞C＞D，即CYP与Na2SeO3质量比＞硝酸浓度＞反应时间＞反应温度。最佳工艺为：A2B3C3D2，即CYP与Na2SeO3质量比为6:4，硝酸浓度为1.4%，反应时间为10 h，反应温度为80 ℃。按此最佳工艺制备的Se-CYP，平行3次，15 mg·mL-1的Se-CYP的α-葡萄糖苷酶抑制率平均为（61.15±1.15）%，高于正交试验中的最大值。

图2 Se-CYP硒含量与α-葡萄糖苷酶抑制率拟合曲线

Figure 2 The fitting curve of the selenium content and-glucosidase inhibition rate of Se-CYP

图3 Se-CYP与CYP的FT-IR图谱

Figure 3 FT-IR spectrum of Se-CYP and CYP

对正交试验结果中制备得到的Se-CYP的硒含量和-葡萄糖苷酶抑制率进行相关性分析，并进行线性拟合，结果见图2。从图2中可以看出，两个变量相关系数2为0.832 9，说明Se-CYP的硒含量与α-葡萄糖苷酶抑制率之间高度正相关。因为硒这种元素本身就与糖尿病的高血糖之间存在密切的关系，有研究称，补充足量的硒对糖尿病的防治具有重要的意义[20]。因此，硒含量越高的Se-CYP对-葡萄糖苷酶的抑制作用表现更为突出。

2.3 Se-CYP与CYP 的红外图谱分析

图4 不同浓度的Se-CYP对α-葡萄糖苷酶活性的影响

Figure 4 Effects of different concentrations of Se-CYP on-glucosidase activity

2.4 不同浓度的Se-CYP对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

以α-葡萄糖苷酶抑制率为指标，按照最佳工艺制备Se-CYP。分别以CYP和阿卡波糖为对照，测定不同浓度的Se-CYP的α-葡萄糖苷酶抑制率，结果见图4。从图4中可以看出，Se-CYP、CYP和阿卡波糖都具有抑制-葡萄糖苷酶的活性，且都表现为剂量依赖性，浓度越高，-葡萄糖苷酶抑制率越大。相同浓度的Se-CYP和CYP的-葡萄糖苷酶抑制率都小于阿卡波糖的-葡萄糖苷酶抑制率。相同浓度的Se-CYP相比CYP表现出更高的-葡萄糖苷酶抑制率。当Se-CYP浓度为5 mg·mL-1时，Se-CYP的-葡萄糖苷酶抑制率相比CYP高出约58.7%；当浓度为10、15、20 和25 mg·mL-1时，Se-CYP的α-葡萄糖苷酶抑制率相比CYP分别高出约73.2%、76.7%、69.1%和64.5%。这是因为偶联在Se-CYP中的Se对CYP的α-葡萄糖苷酶抑制活性有促进作用。因此，Se-CYP是一个比CYP更为优秀的α-葡萄糖苷酶抑制因子候选物。

3 结论

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Preparation of selenium-polysaccharide from Huaishan yam and its inhibitory effect on-glucosidase activity

HU Yan, LIAN Weishuai, XU Meijuan, YUAN Xiaoqing

(College of Food and Bioengineering, Henan University of Animal Husbandry and Economics, Zhengzhou 450046)