基于网络药理学和分子对接技术的西洋参-黄芪治疗2型糖尿病作用机制探究

周莹洁 李思耐 尚菊菊

(1 北京中医药大学临床医学院,北京,100029; 2 首都医科大学附属北京中医医院,北京,100010; 3 北京市中医药研究所,北京,100010)

糖尿病是由胰岛素分泌的绝对或相对不足,和(或)胰岛素敏感性下降导致的糖代谢异常为主要表现的疾病。我国DM以2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)为主,目前T2DM的患病率已达10.4%,治疗以控制危险因素、控制血糖、防治并发症为主[1]。T2DM在中医属于“消渴病”范畴,中医理论认为气阴两虚是T2DM的基本病机之一[2-4]。包含西洋参-黄芪药对的益气养阴中药组方治疗T2DM效果明显[5-6]。药理研究提示,西洋参具有改善胰岛素抵抗的作用[7],黄芪具有改善胰岛素抵抗,增加胰岛素敏感性的作用[8]。但西洋参-黄芪药对作为中医治疗T2DM的常见益气养阴药对,治疗T2DM的作用机制尚不明确。

网络药理学通过构建药物成分-靶点-疾病的相互作用网络,反映了中药的多成分-多靶点-多通路作用关系,从整体出发阐述作用机制,符合中医整体观的思想。分子对接技术主要通过计算机模拟配体与受体的结合,利用结合能判断配体与受体的结合效果。本文通过运用网络药理学的方法,对西洋参-黄芪的主要化学成分、作用靶点进行探究,分析核心靶点及通路,并将西洋参-黄芪部分化学成分和靶点进行分子对接,为今后的相关研究提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 西洋参-黄芪有效化学成分的获取与靶点预测 使用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)结合文献[7,9],收集药物化学成分。选择口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%、类药性(Drug Likeness,DL)≥0.18并且有明确作用靶点的化学成分为有效化学成分[10-11]。利用TCMSP预测靶点,去重后,通过UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)获取经验证的(Reviewed)、人源(Human)靶蛋白。

1.2 T2DM靶点蛋白的获取 使用CTD数据库(http://ctdbase.org)、GeneCards数据库(https://www.genecards.org/),以“diabetes mellitus,type 2”“type 2 diabetes mellitus”为关键词,分别去除重复基因与假阳性基因后,选取交集基因,获取T2DM相关的靶基因。

1.3 有效化学成分、疾病相互作用靶点的映射及相互作用网络构建 将最终纳入的有效化学成分预测靶点、T2DM靶点进行映射取交集,得到西洋参-黄芪作用于T2DM的作用靶点。用Cytoscape 3.7.2软件进行网络结构可视化处理。构建中药化学成分-作用靶点相互作用网络。通过选择自由度≥平均自由度的节点[12],获得西洋参-黄芪治疗T2DM的关键化学成分与核心靶点。结合KEEG通路富集分析结果最终构建关键化学成分-核心靶点-生物通路相互作用网络。

1.4 靶点功能富集分析 使用DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)对获得的核心靶点蛋白进行基因本体(Gene Ontology,GO)分析,用统计学超几何分布定量P<0.01评估存在于各GO注释中的蛋白质群,以P值反映蛋白质生物学功能的显著性。选择生物过程(Biological Process,BP),细胞组分(Cellular Component,CC),分子功能(Molecular Function,MF)3个模块,应用DAVID工具对核心蛋白靶基因进行京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,得到西洋参-黄芪治疗T2DM的主要作用通路。

1.5 分子对接 分别选取西洋参、黄芪度值最高的活性成分为配体,选取度值前5位的靶点作为受体进行分子对接。1)配体的准备:ZINC数据库中下载配体分子结构,保存为Mol2格式。2)受体的准备:利用RCSB PDB数据库下载受体分子结构,选择物种为人,可信度高的分子,保存为pdb格式。3)分子对接:利用Auto Dock对受体、配体进行去水、加氢、加电荷等操作,保存为pdbqt格式,进行分子对接,利用Pymol进行可视化。分子对接结果参照结合能,结合能小于-5 kcal/mol(1 cal=4.184 J)证明配体与受体可以稳定结合,结合能越小结合越稳定。

2 结果

2.1 西洋参-黄芪有效化学成分及作用靶点 收集到西洋参化学成分153个,黄芪化学成分87个。通过筛选并且去除无明确对应靶点的化学成分,得到有效化学成分26个,其中西洋参9个,黄芪17个。见表1。

2.2 西洋参-黄芪作用于T2DM的相关靶点及中药化学成分-作用靶点相互作用网络 收集到西洋参-黄芪作用靶点231个。经UniProt查询后,得到西洋参-黄芪靶基因共184个。T2DM的靶基因方面,除外重复基因,CTD筛选到基因29 049个,GeneCards筛选基因6 127个,最终数据库共有的与T2DM相关的基因5 607个。有效化学成分的靶蛋白与T2DM相关的靶蛋白取交集后,共得到162个靶蛋白。对应25种化学成分,其中西洋参9种,黄芪16种(HQ2除外)。利用Cytoscape软件绘制中药化学成分-作用靶点相互作用网络,共有187个节点(162个靶蛋白,西洋参化学成分9种,黄芪化学成分16种),378条连线。见图1。各个节点“Degree”分布在“1-114”之间,平均度值为4.04,度值≥平均度值的节点为西洋参-黄芪作用于T2DM的关键成分、核心靶蛋白。关键成分共有13种,其中西洋参3种,编号为XYS6、XYS8、XYS9;黄芪10种,编号为HQ4、HQ5、HQ6、HQ8、HQ10、HQ11、HQ12、HQ13、HQ14、HQ16。核心靶点共21个。见表2。西洋参、黄芪度值最大的化学成分分别是XYS9(Beta-Sitosterol,β-谷甾醇)、HQ16(Quercetin,槲皮素)。核心靶点度值前5位的分别是:前列腺素G/H合酶2(Prostaglandin G/H Synthase 2)、核受体共激活剂2(Nuclear Receptor Coactivator 2)、前列腺素G/H合酶1(Prostaglandin G/H Synthase 1)、胰蛋白酶-1(Trypsin-1)、视黄醇X受体-alpha(Retinoic Acid Receptor RXR-alpha)。

图1 中药化学成分-作用靶点相互作用网络注:红色节点代表黄芪化学成分,蓝色节点代表作用靶点,绿色节点代表西洋参化学成分,节点大小与度值成正比

表2 中药化学成分-疾病映射核心靶点信息

2.3 核心靶点的GO分析与KEEG通路富集分析 GO分析涉及18种生物过程、3种细胞组分、17种分子功能。见图2。通过KEEG生物通路分析,西洋参-黄芪核心靶蛋白涉及的12条生物通路分别是:甲状腺癌(Thyroid Cancer)、脂肪细胞内脂肪分解的调节(Regulation of Lipolysis in Adipocytes)、催乳激素信号通路(Prolactin Signaling Pathway)、小细胞肺癌(Small Cell Lung Cancer)、唾液分泌(Salivary Secretion)、甲状腺激素信号通路(Thyroid Hormone Signaling Pathway)、钙信号通路(Calcium Signaling Pathway)、胆碱能突触(Cholinergic Synapse)、心肌细胞的肾上腺素能信号(Adrenergic Signaling in Cardiomyocytes)、神经活动配体-受体相互作用(Neuroactive Ligand-receptor Interaction)、cGMP-PKG信号通路(cGMP-PKG Signaling Pathway)、癌症通路(Pathways in Cancer)。见图3。

图2 核心靶点GO分析注:红色表示生物过程,绿色表示细胞组分,蓝色表示分子功能

2.4 关键化学成分-核心靶点蛋白-生物通路相互作用网络的构建 构建相互作用网络,共有节点46个(13种关键化学成分、21种核心靶点蛋白、12种通路),197条连线。核心靶点蛋白中CHEK1、PGR没有对应KEEG通路分析结果。见图4。

图4 关键化学成分-核心靶点蛋白-通路相互作用网络注:绿色节点代表西洋参关键化学成分,红色节点代表黄芪关键化学成分,紫色节点代表核心蛋白,黄色节点代表通路

2.5 分子对接 关键化学成分中西洋参度值最高的是Beta-sitosterol,黄芪度值最高的是Quercetin。核心靶点蛋白中,度值前5位的是PTGS2、NCOA2、PTGS1、PRSS1、RXRA。Beta-sitosterol不作用于PRSS1靶点。见表3,图5。

图5 β-谷甾醇、槲皮素与靶蛋白分子对接三维模拟

表3 分子对接结合能

3 讨论

益气生津散是已故名老中医王为兰拟定,经夏军,刘红旭等结合临床实践[13],遵循中医辨证治疗原则研制出的茶散剂(由西洋参、黄芪、玉竹、麦冬、石斛、枸杞子、玄参、佛手、砂仁组成),具有益气养阴、生津止渴的功效,能降低血糖,改善口干口渴、倦怠乏力等,用于治疗气阴两虚型消渴病[13-14]。益气生津散可以降低KKAy小鼠随机血糖、胰岛素抵抗指数[15]。西洋参-黄芪药对作为益气生津散的主要成分,二者相配伍,增强益气养阴功效。

西洋参-黄芪作用于T2DM的关键化学成分共13种。这提示了西洋参-黄芪在治疗T2DM上多成分的特点。其中西洋参关键化学成分共3种,黄芪化学成分10种。西洋参度值最大的成分为β-谷甾醇,黄芪化学成分中度值最高的是槲皮素。β-谷甾醇是一种植物甾醇,具有抗氧化、降低胆固醇、抗炎、免疫调节、抗肿瘤和中枢神经系统作用[16]。槲皮素是一种黄酮类的化合物,具有降糖[17]、抗氧化、抗肿瘤、抗炎症、抗菌和保护心血管的作用[18]。

核心靶点分析结果表明,西洋参-黄芪协同干预T2DM的前5位核心靶点是:前列腺素G/H合酶2、核受体共激活剂2、前列腺素G/H合酶1、胰蛋白酶-1、视黄醇X受体-alpha,提示西洋参-黄芪药对可能通过多靶点协同治疗T2DM。分子对接结果显示,β-谷甾醇与PTGS2、NCOA2、PTGS1、RXRA,槲皮素与PTGS2、NCOA2、PTGS1、PRSS1、RXRA靶点能稳定结合,并且β-谷甾醇与槲皮素比较,与各受体之间的结合更稳定性。前列腺素G/H合酶又称环氧化酶,PTGS2、PTGS1是环氧化酶的2种同工酶,共同参与前列腺素的合成[19]。PTGS1、PTGS2与T2DM的病因相关[20-21]。目前PTGS2为靶点的药物已被应用于治疗糖尿病[22]。核受体共激活剂2是类固醇类受体共激活因子p160家族之一。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome Proliferator Activated Receptor γ,PPARγ)的转录活性受P160家族调控[23]。PPARγ与脂肪分化相关。在肥胖小鼠的脂肪组织中核受体辅激活物(Nuclear Receptor Coactivator 2,NCOA2)可以促进3T3-L1细胞的分化;在人脂肪细胞中,NCOA2可促进皮下脂肪前体细胞的分化[24]。胰蛋白酶-1基因可编码阳离子胰蛋白酶原,胰蛋白酶原由胰腺腺泡细胞合成,以无活性的酶原形式存在于胰液中,随胰液分泌到小肠,在肠激酶作用下胰蛋白酶原转变为有活性的胰蛋白酶[25]。类视黄醇X受体(Retinoid X Receptor Protein,RXRA)属于核受体超家族之一,是配体诱导的转录因子,与不同配体结合后,可以在体内代谢紊乱、心血管疾病、糖尿病、炎症等疾病的发病机制中发挥作用[26]。RXRA在肾、表皮、肠、肝脏表达占优势。RXRA拮抗剂可以增加瘦素的敏感性,进而增加胰岛素敏感性,从而调控糖代谢治疗糖尿病[27]。

通过对核心靶蛋白进行GO和KEEG通路富集分析,发现西洋参-黄芪药对治疗T2DM的靶点可能涉及以下3类机制:1)脂肪细胞内脂肪分解调节;2)cGMP-PKG信号通路;3)甲状腺激素信号通路。脂肪分解是增加T2DM患者游离脂肪酸的重要因素,长期高浓度的游离脂肪酸会增加胰岛素抵抗[28]。高浓度葡萄糖也可以刺激脂肪分解,增加游离脂肪酸的水平,并且不能被胰岛素抑制[29]。cGMP-PKG信号通路能够影响胰岛素敏感性及糖尿病患者的心肌细胞。cGMP-PKG信号通路使小鼠骨骼肌在收缩数小时后,胰岛素敏感性不受抑制[30]。对糖尿病患者及非糖尿病者的心脏活检研究显示,受损的cGMP-PKG信号通路是糖尿病心肌细胞硬化的关键调节剂[31]。并且,cGMP-PKG信号通路也具有保护心血管的作用[32]。甲状腺激素具有双向调节胰岛功能、加速胰岛素降解、调节胰岛素敏感性的作用,并且具有保护肾脏、肝脏的作用[33-35]。甲状腺功能亢进时,肠道吸收葡萄糖增多,机体内糖原异生及其他升糖反应的过程都得到过度表达,进一步加重了过高的血糖水平[36],可通过调节肝糖原输出、糖异生量、葡萄糖利用率等机制控制血糖水平[37]。

通过对研究结果进行分析,发现西洋参-黄芪在治疗T2DM具有多成分、多靶点、多通路的特点,其中核心药物成分为β-谷甾醇与槲皮素,关键靶点为PTGS2、NCOA2、PTGS1、PRSS1、RXRA,作用机制可能与脂肪细胞内脂肪分解调节、cGMP-PKG信号通路、甲状腺激素信号通路关系密切。然而,考虑到中药成分的复杂性,网络药理学方法和分子对接技术的局限性,本文的研究结果仍需要进一步的试验验证。

利益冲突声明:无。