指纹图谱结合一测多评在中成药丹参片质量控制中的应用

周亚楠，胡晓茹，戴忠，马双成

中国食品药品检定研究院，北京 100050

丹参片是以丹参为原料提取制得的片剂，收载于《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版（一部），主要用于治疗冠心病、心绞痛等疾病[1]。丹参是唇形科鼠尾草属植物丹参Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根茎，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦等功效。研究表明，丹参主要含水溶性和脂溶性两类成分，这两类成分具有抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗血小板聚集、抗凝血等药理作用，均为丹参的主要活性成分[2-5]。其中，水溶性成分主要为酚酸类成分，如丹酚酸B、丹参素等；脂溶性成分大多为共轭醌、酮类成分，如丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ等。

中药成分复杂，单一成分难以评价中药整体质量，中药指纹图谱及多指标成分定量的方法是现在常用的中药质量控制模式[6-7]。中药指纹图谱体现中药的整体性，提供中药中多成分整体信息，多用于中药的整体质量评价。多指标成分含量测定是中药质量评价的另一种方式，常规的含量测定方法常出现对照品难以获得的不足，一测多评法（QAMS）是以样品中某一组分（对照品易获得且稳定）为参照物，通过相对校正因子计算其他组分的含量，其可以弥补多组分同时测定时对照品难以获得、制备成本高、不稳定等不足。因此，指纹图谱与QAMS相结合可以全方位评价中药质量，已经成为中药质量控制的趋势[8-15]。

《中国药典》2020 年版（一部）以水溶性成分丹酚酸B 控制丹参片的质量，并未收载脂溶性成分的测定方法[16]，质量控制指标不完整，难以全面准确反映丹参片的质量。本研究采用QAMS，以丹参酮ⅡA为参照物同时测定丹参片中丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ的含量，并结合指纹图谱全面、科学地评价丹参片的质量，为丹参片的质量控制提供良好的技术手段，同时为丹参片的质量标准研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

E2695 型高效液相色谱仪（Waters 公司）；1260型高效液相色谱仪（Agilent公司）；KQ-300DA 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；XPE105型十万分之一电子分析天平（Mettler-Toledo公司）。

1.2 试药

对照品丹参酮ⅡA（批号：110766-201721，纯度：99.5%）、隐丹参酮（批号：110852-201807，纯度：99.0%）、丹参酮Ⅰ（批号：110867-201607，纯度：98.0%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯；水为超纯水；磷酸为分析纯。

丹参片编号为S1～S3（A 厂家，批号分别为170934、170935、170936）；丹参片编号为S4～S6（B 厂家，批号分别为180101、180401、180402）；丹参片编号为S7～S12（C 厂家，批号分别为180405、180406、180407、180408、180501、180502）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

混合对照品溶液的制备：分别取丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ对照品约10、15、10 mg，精密称定，分别置于50、50、100 mL 棕色量瓶中，加入甲醇适量，超声使溶解（300 W，50 kHz），并定容至刻度，摇匀，即得对照品储备液。取丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ对照品储备液各5 mL，置于同一50 mL 棕色量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液的制备：取丹参片20 片，除去糖衣，研细，取约0.8 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理20 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件

CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.02%磷酸水溶液（B）为流动相梯度洗脱（0～6.0 min，61%A；6.0～20.0 min，61%～90%A；20.0～20.5 min，90%～61%A；20.5～25.0 min，61%A）；检测波长：270 nm；进样量：10 µL。

2.3 指纹图谱研究

2.3.1 精密度试验 取同一供试品溶液（S7）按2.2 项下色谱条件连续进样6 次，以丹参酮ⅡA为参照峰，测定各共有峰的相对保留时间及相对峰面积。结果显示，各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于3.0%，仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取同一批丹参片（S7）按2.1项下方法平行制备6 份供试品溶液，以丹参酮ⅡA为参照峰，各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取同一供试品溶液（S7）分别在0、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h连续进样测定，以丹参酮ⅡA为参照峰，各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD 均小于3.0%，表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.3.4 指纹图谱的建立、共有峰指认及相似度评价 按2.2 项下色谱条件对12 批丹参片供试品溶液进行测定，比较各批供试品的色谱图，共标定5 个共有峰。以乙腈-0.02%甲酸为流动相，采用超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）正离子模式扫描对未知峰进行确认，峰1的母离子m/z为279.103 8，碎片离子m/z为261、251、233、205、169，最大吸收波长为242、290 nm，峰2的母离子m/z为338.974 5，碎片离子m/z为279、261、233，最大吸收波长为224、272 nm，经文献对比确认峰1、峰2分别为二氢丹参酮Ⅰ、丹参酸甲酯[17-20]。峰3 的母离子为297.128 7，最大吸收波长为219、263 nm，峰4 的母离子m/z为277.150 0，最大紫外吸收为244 nm，峰5 的母离子m/z为295.111 9，最大吸收波长为224、269 nm，经对照品比对、质谱及紫外确认，峰3、峰4、峰5 分别为隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA。

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版）对12 批丹参片的指纹图谱进行相似度评价，以S1 为参照谱图，选定5 个特征峰进行多点校正，全谱峰匹配。匹配后的12 批样品图谱见图1，平均数法生成对照图谱（图2）。12 批丹参片的相似度分别为0.997、0.996、0.996、0.998、0.997、0.996、1.000、1.000、0.999、1.000、1.000、1.000，结果显示12 批样品的图谱与对照指纹图谱相似度较高，表明12 批丹参片的脂溶性化学成分一致性较好。

图1 各批次丹参片的叠加色谱图

图2 丹参片对照指纹图谱

2.4 QAMS研究

隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA是丹参片中主要脂溶性成分，也是主要活性成分。本研究采用QAMS，以丹参酮ⅡA为对照同时测定隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的含量，提高丹参片的质量控制水平。

2.4.1 专属性 取供试品溶液、混合对照品溶液及空白溶剂，按2.2 项下色谱条件分析，结果见图3。隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA分离良好，空白溶剂在3 个成分保留时间处无色谱峰干扰，供试品中出现与对照品溶液中一致的色谱峰，表明本法专属性良好。

图3 空白溶剂、对照品及丹参片供试品色谱图

2.4.2 线性关系考察 逐级稀释对照品储备液1～100 倍，得到7 个不同质量浓度的对照品溶液，按2.2 项下色谱条件分析，以峰面积为纵坐标（Y），对照品溶液质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表1。

表1 丹参片中3个成分的线性关系结果

2.4.3 精密度试验 取同一供试品溶液（S7）连续进样6 次，结果丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ峰面积的RSD 分别为0.17%、0.20%、0.37%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 重复性试验 取同一批丹参片（S7）平行制备6份供试品溶液，进行HPLC分析，计算丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ的含量。结果丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ含量的RSD 分别为1.64%、1.25%、2.46%，表明方法重复性良好。

2.4.5 稳定性试验 取同一供试品溶液（S7）及混合对照溶液分别在0、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h 连续进样测定，供试品溶液中丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ峰面积的RSD 分别为0.53%、0.87%、0.61%，对照品溶液中丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ峰面积的RSD 分别为0.39%、0.44%、0.53%，表明对照品及供试品溶液在48 h内稳定。

2.4.6 回收率试验 取丹参片（S7）粉末9 份，各约0.4 g，精密称定，平均分为3 组，每组分别精密加入丹参酮ⅡA对照品储备液1、2、3 mL，隐丹参酮对照品储备液1、2、3 mL，丹参酮Ⅰ对照品储备液1、3、5 mL，按2.1项下方法制备，进样分析后，计算平均加样回收率，丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ的平均回收率分别为101.27%、99.56%、101.49%，RSD 分别为0.80%、0.76%、1.22%，表明方法准确性良好。

2.4.7 相对校正因子的计算 常用的相对校正因子计算方法有多点校正法、斜率校正法和定量因子校正法[21]。取2.4.2项下溶液，按2.2项下色谱条件测定，采用斜率校正法计算隐丹参酮、丹参酮Ⅰ相对丹参酮ⅡA的校正因子分别为1.16、1.37。仪器、色谱柱、流速等的微小改变会影响相对校正因子的大小。因此，分别选择了2 个品牌仪器（Waters E2695 型、Agilent 1260 型）、3 根色谱柱（CAPCELL PAK C18MG Ⅱ、Kromasil 100-5-C18、COSMOSIL Packed Column 5C18-MS-Ⅱ，规格均为250 mm×4.6 mm，5 μm），同时改变流速，考察其对待测成分相对校正因子测定的影响，结果见表2。

表2 不同仪器、不同色谱柱和不同流速条件下丹参片中主要成分的相对校正因子

2.4.8 待测成分色谱峰定位 本研究将待测成分光谱信息与相对保留值相结合对各成分色谱峰进行准确定位。隐丹参酮的最大吸收波长为219、263 nm，丹参酮Ⅰ的最大吸收波长为244 nm，改变仪器、色谱柱、流速后，隐丹参酮、丹参酮Ⅰ的相对保留时间见表3，各待测成分相对保留时间的RSD均小于3%。

表3 不同仪器、不同色谱柱和不同流速条件下丹参片中主要成分的相对保留时间

2.4.9 样品测定 按2.1、2.2项下方法分析不同批次的丹参片，采用对照品外标法和QAMS 计算丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ的含量及其总含量（表4），对照品外标法和QAMS 对丹参片定量测定结果基本一致。

表4 丹参片中各成分的QAMS与外标法测定结果mg/片

3 讨论

本研究采用中药指纹图谱获得丹参片脂溶性成分的整体信息，采用QAMS以丹参酮ⅡA为参照物测定丹参片中脂溶性成分丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ的含量，中药指纹图谱结合QAMS 可以很好地实现整体评价制剂的质量。

QAMS 常用的指标成分色谱峰定位方法有相对保留值和保留时间差[21-22]，《中国药典》 2020年版丹参药材项下以丹参酮ⅡA为参照，采用相对保留值法确定丹参酮Ⅰ、隐丹参酮的色谱峰，从而测定丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮的含量。但实验发现隐丹参酮与丹参酮Ⅰ在不同色谱柱上的目标峰的相对位置有时会互换，如ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱上丹参酮Ⅰ先于隐丹参酮出峰，CAPCELL PAK C18MG Ⅱ（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Kromasil 100-5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）等色谱柱上隐丹参酮先于丹参酮Ⅰ出峰。因此，仅根据相对保留值和保留时间差对指标成分色谱峰定位有时会出现问题。增加供试品的典型色谱图，规定相对保留时间，同时，利用丹参酮Ⅰ、隐丹参酮2 种成分最大紫外吸收波长不同（丹参酮Ⅰ：244 nm，隐丹参酮：219、263 nm）可确定各成分的色谱峰位置，实现对目标峰定位，有效果补充了QAMS 中指标成分色谱峰定位的不足。

丹参酮ⅡA具有光不稳定性及热不稳定性[23-24]，本研究采用超声提取法作为丹参片中脂溶性成分的提取方法，高效、快速，避免了光照、高温使丹参酮ⅡA转化分解造成的误差。同时，考察了提取溶剂（水、25%、50%、75%甲醇、纯甲醇）、提取时间（10、20、30、40 min）等主要因素的影响，最终确定样品提取条件为50 mL甲醇超声处理20 min。

本研究提出并建立了指纹图谱结合QAMS 全面评价丹参片中脂溶性化学成分的方法，具有灵敏度强、准确度高、重复性好、稳定性好的特点，可为丹参片的质量控制提供参考。