风轮菜中1个新的单萜△

赵迪，伍一炜，徐玉岩，范佳萍，张韵寒，杨蕊嶷，汪洪，吴丽丽，徐暾海*，朱寅荻

1.北京中医药大学 中药学院，北京 100029；

2.温州医科大学 药学院，浙江 温州 325035；

3.北京中医药大学 中医学院，北京 100029

风轮菜Clinopodium chinense（Benth.）O.Kuntze 别名九塔草、山薄荷、苦刀草，为唇形科（Labiatae）风轮菜属（ClinopodiumLinn.）植物，主产于山东、浙江、江苏、安徽、江西和福建等地[1]。《中华人民共和国药典》2020 年版收载风轮菜干燥地上部分为中药断血流，具有收敛止血的功效，用于崩漏、尿血、鼻衄、牙龈出血和创伤出血[2]。研究发现，风轮菜属药用植物中含有三萜及其皂苷、黄酮、挥发油、苯丙素等类成分，其中皂苷、黄酮是该属植物的主要活性成分。这些成分表现出多种生物学活性，包括抗炎止血[3]、抗高血糖、抗肿瘤、免疫抑制、心脏保护和抗辐射[4]。本课题组前期研究发现，断血流具有活血和止血的活性，具有良好的开发价值。本研究对风轮菜的化学成分进行进一步研究，从中分离出9 个化合物，分别为 (4S,9S)-9-羟基茉莉酮（1）、红花菜豆酸（2）、环-(S-脯氨酸-R-亮氨酸)（3）、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯（4）、2-甲氧基-4-(2-丙烯基)-苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（5）、吐叶醇（6）、柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸（7）、对-薄荷-3,8-二烯-1,2-二醇（8）、黄麻香堇醇C（9），结构见图1。其中化合物1为新化合物，化合物2～3、5～6、8 为首次从风轮菜中分离得到。评估了从风轮菜提取物中分离得到的化合物1、6、9 的细胞保护活性，发现化合物9 对棕榈酸（PA）诱导的肝癌HepG2 细胞损伤具有显著的细胞保护活性（P＜0.001），且与剂量呈正相关，化合物6 在高剂量时有一定的细胞保护活性（P＜0.05）。

图1 风轮菜中分离得到的化合物1～9

1 材料

1.1 样品

风轮菜购买于安徽省亳州市中药材市场，经温州医科大学药学院汪洪副教授鉴定为唇形科风轮菜属植物风轮菜Clinopodium chinense（Benth.）O.Kuntze。样品标本（20170820）现存于温州医科大学药学院。

1.2 细胞

HepG2 细胞为北京中医药大学基础医学院保存细胞株。

1.3 仪器与耗材

QoneAS400 型核磁共振波谱仪（武汉中科牛津波谱技术有限公司）；LTQ-Orbitrap XL 型质谱仪（美国Thermo-Fisher 公司）；PolA Ar 3005 型全自动旋光仪（英国Optical Activity 公司）；TU19 型双光束紫外-可见光分光度计（北京普析通用仪器有限公司）；FTIR-850 型傅里叶变换红外光谱仪（天津港东科技发展股份有限公司）；1260-6120 型液相色谱-单四极杆质谱联用仪、1100 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；HERA cell 150i 型恒温CO2培养箱（美国Thermo Scientific 公司）；HDL 型超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；IX71 型倒置显微镜（日本Olympus 公司）；Glomaxmulti 型酶标仪（美国Promega 公司）；3k15 型台式高速低温冷冻离心机（美国Sigma-Aldrich 公司）；R200D 型分析天平（德国赛多利斯集团）；C100 型自动细胞计数仪（瑞沃德生命科技有限公司）。

Pack ODS-A型半制备色谱柱（250 mm×10 mm，5 μm）、C18反相填料均购于日本YMC 公司；柱色谱和薄层色谱硅胶（青岛海洋化工厂）；D101 型大孔吸附树脂（南开大学）；Sephadex LH-20（瑞典Amersham Biosciences公司）。

1.4 试剂

DMEM 低糖培养基（美国Gibco 公司）；链霉素、青霉素（北京博奥拓科技有限公司）；胎牛血清（美国O-RIGIN公司）；牛血清白蛋白（BSA）、棕榈酸（PA）、细胞活力检测试剂盒（CCK-8）均购于北京索莱宝科技有限公司；0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液（1×，美国Hyclone公司）。

2 方法

2.1 提取与分离

取风轮菜干燥地上部分60 kg，粉碎，经70%乙醇提取，回收溶剂后加水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，回收溶剂得到各部分萃取物；将正丁醇萃取物经D101 大孔吸附树脂柱分离，以30%、50%、70%、95%乙醇梯度洗脱，依次得到组分Fr.A～Fr.D。Fr.A 经硅胶柱色谱（100～200 目）分离，二氯甲烷-甲醇（100∶0～100∶50）梯度洗脱、薄层色谱检识，得22个组分（Fr.A.1～Fr.A.22）；Fr.A.1 经C18反相柱色谱分离，甲醇-水（30∶70～90∶10）梯度洗脱，经薄层色谱检识得到5 个组分（Fr.A.1.1～Fr.A.1.5）。Fr.A.1.4 经硅胶柱色谱（100～200 目）分离，二氯甲烷-甲醇（100∶5）洗脱，Sephadex LH-20 柱色谱及半制备高效液相色谱（检测波长210 nm）分离纯化得到化合物8（6 mg，甲醇-水40∶60，tR=26 min）。Fr.A.2经C18中压柱色谱分离，甲醇-水（30∶70～90∶10）梯度洗脱，经薄层色谱检识，得到3 个组分（Fr.A.2.1～Fr.A.2.3），Fr.A.2.2再经硅胶柱色谱（100～200目）分离，以石油醚-乙酸乙酯（100∶5～100∶50）梯度洗脱，经薄层色谱检识，得到12个组分（Fr.A.2.2.1～Fr.A.2.2.12）。将Fr.A.2.2.6～Fr.A.2.2.7 经Sephadex LH-20 柱色谱及半制备高效液相色谱（检测波长210 nm）分离纯化得到化合物1[14 mg，甲醇-水（35∶65），tR=28 min]、2 [5 mg，甲醇-水（35∶65），tR=38 min]、3 [6 mg，甲醇-水（38∶62），tR=21 min]、6 [16 mg，甲醇-水（31∶69），tR=46 min]，9 [10 mg，甲醇-水（31∶69），tR=43 min]。Fr.A.2.3 再经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇（100∶0～100∶50）梯度洗脱，经薄层色谱检识，得到13个组分（Fr.A.2.3.1～Fr.A.2.3.13）。Fr.A.2.3.10 经C18中压柱色谱分离，以甲醇-水（30∶70～90∶10）梯度洗脱，得到3个组分（Fr.A.2.3.10.1～Fr.A.2.3.10.3。Fr.A.2.3.10.2 经硅胶柱色谱（100～200 目）分离，二氯甲烷-甲醇（100∶5～100∶25）梯度洗脱，经薄层色谱检识，合并得到4个组分（Fr.A.2.3.10.2.1～Fr.A.2.3.10.2.4）。Fr.A.2.3.10.2.4 经Sephadex LH-20 柱色谱分离得到化合物4（8 mg，淡黄色不溶物析出，析出溶剂为甲醇）。Fr.A.2.3.10.3 经Sephadex LH-20 柱色谱及半制备高效液相色谱分离纯化（检测波长210 nm）得到化合物7 [8 mg，甲醇-水（54∶46），tR=30 min]。

2.2 细胞保护活性

分别检测化合物1、6、9 的细胞保护活性。用0.5 mmol·L-1PA处理HepG2细胞24 h，制备细胞损伤模型[5]，将造模后的HepG2细胞接种在96孔板中，密度为5×103个/孔。将细胞置于37 °C、含5% CO2的细胞培养箱中培养24 h。每孔加入不同质量浓度（5、10、20 μg·mL-1）的化合物1、6、9 10 μL刺激细胞，同时设置空白组（不加细胞）、对照组和模型组（不加药物）。将96 孔板在37 °C、含5% CO2及100%湿度的细胞培养箱中孵育24 h。每孔加入培养基100 μL（含CCK-8 溶液10 μL）。37 °C、含5%CO2的培养箱中孵育2 h。用酶标仪在450 nm 处测定吸光度（A）。根据公式（1）计算细胞存活率。

3 结果

3.1 结构鉴定

HMBC中δH4.65 (1H,dd,J=6.2,1.8 Hz,H-4) 与δC208.0 (C-1),140.6 (C-2),173.1 (C-3),45.1 (C-5)有远程相关，δH2.17 (1H,dd,J=17.8,1.8 Hz,H-5a),2.73 (1H,dd,J=17.8,6.2,H-5b) 与δC208.0 (C-1),140.6 (C-2),173.1 (C-3),72.1 (C-4) 有远程相关；在1H-1H COSY 谱，H-4 与H-5 有相关峰（图2）。根据以上数据推测该化合物含有1 个α、β不饱和酮的五元环片段。在HMBC 谱中，δH5.27 (1H,m,H-7),5.40 (1H,br t,J=10.8 Hz,H-8) 与δC64.3 (C-9) 有远程相关，δH4.74 (1H,m,H-9) 与δC126.8 (C-7),136.3 (C-8),23.8 (C-10) 有远程相关，在1H-1H COSY 谱可见H-6、H-7、H-8、H-9、H-10 有相关峰。根据以上数据推测该化合物有1个含有5个碳的烯烃侧链。由H-6 与C-1，H-7 与C-2 有HMBC 远程相关，可推测出烯烃侧链与C-2相连。

图2 化合物1的主要1H-1H COSY和HMBC相关

由H-4 与C-11 (δC14.0) 有HMBC 远程相关，Me-11 与C-2、C-3、C-4 有HMBC 远程相关，可推测出C-3 位连有1 个甲基。通过1H-1H COSY 谱可推测出C-9 连有1 个羟基，通过1H-1H COSY 和HMBC谱可推测出C-4 连有1 个羟基。根据H-8 的耦合常数（J=10.8 Hz）推断双键Δ7,8的构型为Z。以上数据推测化合物1 为茉莉酮[6]的9 号位连了1 个羟基，因此化合物1有C-4和C-9 2个手性碳。

CD 谱中，化合物1 显示在230 nm 处有1 个负Cotton 效应，根据相关文献对比[7]，推测化合物1 的C-4 的绝对构型为S。通过实验电子圆二色谱（ECD）与计算ECD 对比（图3）确定化合物1 的绝对构型，采用IEFPCM 模型，以甲醇为溶剂，在B3LYP/6-31G (d) 水平上计算 (4S,9S)-1、(4R,9S)-1、(4S,9R)-1 和 (4R,9R)-1 的理论ECD 谱[8]，结果表明计算出的 (4S,9S)-1 ECD 谱与实验ECD 谱吻合，确定化合物C-4 的绝对构型为S，推测C-9 的绝对构型为S（图3）。至此，化合物1 命名为 (4S,9S)-9-羟基茉莉酮 [(4S,9S) -9-hydroxyjasmololone]，通过1H-1HCOSY、HSQC、HMBC 谱对该化合物的所有氢碳信号进行了全归属，见表1。

表1 化合物1的1H-和13C-NMR数据（400/100 MHz,CD3OD)

图3 化合物1的实测与不同构型计算ECD图

化合物2：黄色油状物，易溶于甲醇；结合1H-和13C-NMR谱，推测化合物2分子式为C15H20O5；ESIMSm/z: 303 [M+Na]+；1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:5.81 (1H,s,H-2),8.08 (1H,d,J=16.0 Hz,H-4),6.50(1H,d,J=16.0 Hz,H-5),2.07 (3H,s,H-6),2.80 (1H,d,J=17.8 Hz,H-3'a),2.48 (1H,dd,J=2.0,18.0 Hz,H-3'b),2.71 (1H,dd,J=2.4,18.0 Hz,H-5'a),2.42 (1H,dd,J=2.4,18.0 Hz,H-5'b),1.21 (3H,s,H-7'),3.65 (1H,d,J=7.8 Hz,H-8'a),3.92 (1H,dd,J=3.2,7.8 Hz,H-8'b),1.09 (3H,s,H-9')；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ: 169.7 (C-1),119.9 (C-2),151.3 (C-3),133.0 (C-4),133.7 (C-5),21.3 (C-6),83.0 (C-1'),87.9 (C-2'),54.1 (C-3'),211 (C-4'),53.3 (C-5'),48.7 (C-6'),19.5 (C-7'),78.6 (C-8'),15.9 (C-9')。以上数据与文献报道一致[9]，故鉴定化合物2为红花菜豆酸。

化合物3：无色片状晶体（甲醇）；ESI-MSm/z:211 [M+H]+；结合1H-和13C-NMR谱，推测其分子式为C11H18O2N2；1H-NMR (CD3OD,400 MHz)δ: 5.77(1H,brs,N-H),3.47～3.54 (2H,m,H-3),1.92～2.30(4H,m,H-4,5),4.15 (1H,t,J=8.4 Hz,H-6),4.09(1H,dd,J=9.6,3.4 Hz,H-9),2.04 (1H,m,H-10),1.50 (1H,dd,J=14.6,9.6 Hz,H-10),1.76～1.67 (1H,m,H-11),0.93～0.99 (6H,m,Me-12,13)；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ: 173.0 (C-1),46.6 (C-3),23.8(C-4),29.2 (C-5),60.4 (C-6),169.1 (C-7),54.8 (C-9),39.6 (C-10),25.9 (C-11),23.5 (C-12),22.4 (C-13)。以上数据与文献报道的一致[10]，故化合物3 鉴定为环-(S-脯氨酸-R-亮氨酸)。

化合物4：淡黄色粉末；ESI-MSm/z: 459 [M-H]-；结合1H-和13C-NMR 谱推测其分子式为C22H20O11；1H-NMR (400 MHz,C5D5N)δ: 7.83 (2H,d,J=9.0 Hz,H-2',6'),7.10 (2H,d,J=9.0 Hz,H-3',5'),6.78(1H,s,H-3),6.76 (1H,d,J=2.2 Hz,H-8),6.54 (1H,d,J=2.2 Hz,H-6),5.43 (1H,d,J=5.6 Hz,H-1″),3.64 (3H,s,-OCH3)；13C-NMR (100 MHz,C5D5N)δ:164.9 (C-2),103.9 (C-3),182.9 (C-4),157.7 (C-5),101.6 (C-6),163.5 (C-7),95.2 (C-8),162.6 (C-9),106.7 (C-10),122 (C-1'),128.8 (C-2',6'),162.7 (C-4'),116.7 (C-3',5')，100.4 (C-1″),74.3 (C-2″),77.4 (C-3″),72.7 (C-4″),77.1(C-5″),170.2 (C-6″),51.9 (-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[11]，故鉴定化合物4为芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯。

化合物5：白色粉末，易溶于甲醇；ESI-MSm/z: 327 [M+H]+；结合1H-和13C-NMR 谱推测其分子式为C16H22O7；1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 6.82(1H,br s,H-3),6.72 (1H,br d,J=8.6 Hz,H-5),7.08(1H,d,J=8.6 Hz,H-6),3.46 (2H,dd,J=8.2,1.6 Hz,H-7),5.95 (1H,m,H-8),5.01 (1H,d,J=18.6 Hz,H-9a),5.03 (1H,d,J=18.6 Hz,H-9b),4.84 (1H,d,J=7.8 Hz,H-1'),3.33～3.51 (4H,m,H-2',3',4',5'),3.69 (1H,m,H-6'a),3.87 (1H,br d,J=12.2 Hz,H-6'b),3.84 (3H,s,2-OCH3)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 146.3 (C-1),150.4 (C-2),114.0 (C-3),136.6 (C-4),122.2 (C-5),118.0 (C-6),40.8 (C-7),138.8 (C-8),116.0 (C-9),103.2 (C-1'),75.1 (C-2'),78.0 (C-3'),71.2 (C-4'),78.0 (C-5'),62.6 (C-6'),56.8 (2-OCH3)。以上数据与文献报道一致[12]，故鉴定化合物5 为2-甲氧基-4-(2-丙烯基)-苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物6：无色油状物，易溶于甲醇；ESI-MSm/z: 247 [M+Na]+；；结合1H-和13C-NMR 谱推测其分子式为C13H20O3。1HNMR (400 MHz,CD3OD)δ: 2.49 (1H,d,J=17.0 Hz,H-2b),2.14 (1H,d,J=17.0 Hz,H-2a),5.86 (1H,s,H-4),5.76 (1H,d,J=15.6 Hz,H-7),5.80 (1H,d,J=15.6 Hz,H-8),4.33 (1H,m,H-9),1.23 (3H,d,J=6.4 Hz,H-10),1.03 (3H,s,H-11),1.01 (3H,s,H-12),1.90 (3H,d,J=1.4 Hz,H-13)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 42.6 (C-1),50.9 (C-2),201.4 (C-3),127.3(C-4),167.6 (C-5),80.1 (C-6),130.1 (C-7),137.1 (C-8),68.8 (C-9),24.0 (C-10),23.6 (C-11),24.7 (C-12),19.7 (C-13)。以上数据与文献报道基本一致[13]，故鉴定化合物6为吐叶醇，与化合物9互为异构体，两者具有相同的氢谱和碳谱数据，但比旋光度不同，查阅文献推测为9 号位构型异构。两者在流动相为31%甲醇的半制备高效液相色谱图上显示2 个峰。其中化合物9的出峰时间为43 min，化合物6的出峰时间为46 min。

化合物7：白色无定型粉末；ESI-MSm/z: 449[M+H]+；结合1H-和13C-NMR 谱推测其分子式为C21H20O11。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 5.39 (1H,br d,J=12.0 Hz,H-2),3.20 (1H,dd,J=17.0,3.2 Hz,H-3a),2.74 (1H,dt,J=17.0,3.2 Hz,H-3b),6.17 (2H,m,H-6,8),7.32 (2H,d,J=8.5 Hz,H-2',6'),6.82(2H,d,J=8.4 Hz,H-3',5'),5.07 (1H,t,J=8.4 Hz,H-1″),3.60 (1H,t,J=9.2 Hz,H-2″),3.48 (2H,m,H-3″,4″),4.08 (1H,d,J=9.2 Hz,H-5″)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 166.8 (C-5),98.0 (C-6),165.2 (C-7),97.0(C-8),164.7 (C-9),105.1 (C-10),131.0 (C-1'),130.8(C-2'),116.3 (C-3'),159.3 (C-4'),116.5 (C-5'),129.3 (C-6'),171.0 (C-6″),198.8 (C-4),44.4 (C-3),80.8 (C-2),101.2 (C-1″),77.1 (C-2″),76.8 (C-3″),74.5 (C-4″),73.0 (C-5″)。以上数据与文献报道对照基本一致[14]，故确定化合物7为柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸。

化合物8：无色油状物，易溶于甲醇；ESI-MSm/z: 169 [M+H]+；结合1H-和13C-NMR 谱推测其分子式 为C10H16O2。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 4.04(1H,br s,H-2),5.73 (1H,br s,H-3),2.39 (1H,m,H-5a),2.28 (1H,m,H-5b),1.84 (1H,m,H-6a),1.60(1H,m,H-6b),1.93 (3H,s,H-7),5.08 (1H,s,H-9a),4.96 (1H,s,H-9b),1.18 (3H,s,H-10)；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ: 144.1 (C-8),139.0 (C-4),127.3 (C-3),112.7 (C-9),21.9 (C-6),21.0 (C-10),34.6 (C-5),25.4 (C-6),75.1 (C-2),72.6 (C-1)。以上数据与文献报道一致[15]，故鉴定化合物8 为对-薄荷-3,8-二烯-1,2-二醇。

化合物9：无色油状物，易溶于甲醇；ESI-MSm/z: 247 [M+Na]+；结合1H-和13C-NMR 谱推测其分子式为C13H20O3。1HNMR (400 MHz,CD3OD)δ: 5.87 (1H,s,H-4),5.77(1H,d,J=16.2 Hz,H-7),5.79 (1H,d,J=16.2 Hz,H-8),4.32 (1H,m,H-9),2.48 (1H,d,J=17.0 Hz,H-2β),2.15 (1H,d,J=17.0 Hz,H-2α),1.24 (3H,d,J=7.0 Hz,H-10),1.04 (3H,s,H-11),1.01 (3H,s,H-12),1.91(3H,d,J=1.4 Hz,H-13)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 42.6 (C-1),50.9 (C-2),201.4 (C-3),127.3 (C-4),167.7 (C-5),80.1 (C-6),130.3 (C-7),137.1 (C-8),68.9 (C-9),24.0 (C-10),23.6 (C-11),24.7 (C-12),19.8 (C-13)。以上数据与文献报道基本一致[16]，故鉴定化合物9为黄麻香堇醇C。

3.2 细胞保护活性

实验结果（表2）显示，化合物9 对PA 诱导的HepG2 细胞损伤具有显著的细胞保护活性（P＜0.001），且与剂量呈正相关，其中化合物9 的细胞保护活性较好。化合物6 高剂量组具有一定的细胞保护活性（P＜0.05），而分离得到的新化合物没有表现出明显的细胞保护活性。

表2 化合物1、6、9对PA诱导的HepG2细胞存活率的影响（±s,n=6）

表2 化合物1、6、9对PA诱导的HepG2细胞存活率的影响（±s,n=6）

注：与对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，***P＜0.001。

4 小结

断血流是我国传统中药，用药历史悠久，具有收敛止血的功效。断血流片、断血流胶囊和断血流颗粒用于崩漏、尿血、鼻衄、牙龈出血和创伤出血。研究发现皂苷是其止血主要活性成分[17]，酚酸类成分具有抗心肌缺血再灌注损伤和辅助治疗肿瘤的作用[18]。为进一步开发断血流提供依据，本研究对风轮菜70%乙醇提取物的正丁醇萃取部位进行化学成分和药理作用研究，从风轮菜中分离鉴定出9 个化合物，其中1 个新化合物，并通过实验圆二色谱与计算圆二色谱确定和推测了新化合物4号位和9号位的绝对构型。以PA处理HepG2细胞损伤为模型，对化合物1 及其异构体化合物6 和9 进行了细胞保护活性研究，化合物9的活性较好，推测9号位的构型影响其活性。本研究为风轮菜的后续研究及相关新药研发提供了依据。