基于气味分析系统的不同产地秦艽的区分及相关性研究△

林丽，高素芳，晋玲*，陈红刚，崔治家，王亚丽

1.甘肃中医药大学 药学院，甘肃 兰州 730000；

2.西北中藏药协同创新中心，甘肃 兰州 730000

秦艽Gentiana macrophyllaPall.别名大叶龙胆、大叶秦艽、西秦艽[1]，为常用中药，在藏族药、蒙古族药中也常用。《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版规定药材秦艽为龙胆科植物秦艽G.macrophyllaPall.、麻花秦艽G.stramineaMaxim.、粗茎秦艽G.crassicaulisDuthie ex Burk.或小秦艽G.dahuricaFisch.的干燥根。秦艽属植物种类繁多，主要以野生资源为主，但滥采滥挖使其资源匮乏，伪品频繁出现导致药材市场混乱，因此本研究对《中国药典》2020 年版规定的4 种基原的秦艽属植物及其他几种秦艽属植物进行相关性研究。

目前，秦艽属植物的质量评价主要集中在传统鉴别手段及高效液相色谱[2-5]、气相色谱技术[6]方面，缺少传统感官评价的全局性、整体性、模糊性[7]。20世纪90 年代发展起来的电子鼻是模拟生物嗅觉传导机制设计的，由传感器阵列和适当的模式识别系统组成，其识别的是样品中挥发性成分的整体信息，亦称“电子指纹”[8-21]。由于电子鼻的特点及其方便快捷的优越性，其已被广泛应用于环境检测、食品工业、农业等方面[22-30]，但其在中药材、中成药领域的应用研究报道尚不多见。外观性状是中药质量重要评价指标，涉及到形态、色泽、气味、质地等方面。其中，颜色和气味是中药外观质量检查中的主要指标。由于目前仍是通过眼看、鼻闻、口尝的方法来控制中药的颜色和气味，检测结果不可避免地受到感观差异和检测环境的影响，客观性和准确性难以保证。而电子鼻客观评价气味，使得其在客观表达和控制中药外观信息气味方面表现出巨大的应用潜力，而电子鼻的工作原理恰恰符合传统中药“四气五味”的药性原理。

因此，本研究以39 批秦艽为研究对象，通过电子鼻技术建立一种针对秦艽的准确性好且简便可行的鉴别方法，为中药材挥发性成分的鉴定提供新思路和方法。

1 材料

1.1 试药

39 批秦艽样品经甘肃中医药大学晋玲教授鉴定，样本保存在甘肃中医药大学药学院实验教学中心中药标本室，具体信息见表1。

表1 秦艽样品信息

1.2 仪器

Pen3型电子鼻（德国Airsense公司），12根传感器均为金属氧化物传感器，传感器具体信息见表2；XSE 205DU型十万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

表2 电子鼻金属氧化物传感器信息

2 方法

2.1 样品制备

选取庆阳市合水县野生X1秦艽样品，用粉碎机打粉，分别过20、40、60、80、100 目筛，编号后密封保存以防气味散失。

2.2 电子鼻数据采集

采用直接顶空吸气法，设置电子鼻的工作参数，待仪器运行稳定后，称取适量样品置于样品瓶中密封放置固定时间，在室温条件下直接将进样针头插入装有秦艽粉末的10 mL 顶空进样瓶中进行气味数据的采集，每个样品做3个重复。

2.3 因素水平及条件筛选

初步设计为4 个影响因素，分别为样品颗粒度大小、电子鼻进气量、测量前密封放置时间及被检测样品的称样量；单因素水平均设置为5 个水平，每水平3个重复。

2.4 检测条件的优化

设定进气量分别为100、150、200、250、300 mL·min-1，放置时间分别为5、10、15、20、25 min，样品质量分别为1、2、3、4、5 g。

2.5 数据分析

采用Winmuster 1.6.2 软件中的主成分分析（PCA）、线性判别分析方法（LDA）及负荷加载分析法（Loadings）对实验数据进行分析。

3 结果与分析

3.1 电子鼻响应值及因素水平筛选

采用电子鼻对秦艽样品的气味进行采集，得到10 个传感器的响应图（图1）。图1 中，每条曲线代表1 个传感器，曲线上的点代表秦艽的气味物质通过传感器通道时相对电阻率（G/G0，其中G为被测气体的响应值，G0为空气的响应值）随进样时间的变化情况。由图1 可知，从进样初到最终样品气体平稳过程中，G/G0快速增加，然后有所降低，最后趋于稳定，表明电子鼻对秦艽气味识别灵敏、稳定，说明秦艽气味中所含的化学成分相对稳定、挥发性较好，可采用电子鼻进行测定。

图1 电子鼻对秦艽的响应曲线

将电子鼻测得的数据输入SPSS 25 软件中进行分析，考察样品颗粒度、电子鼻进气量、密封放置时间及样品称样量对主要成分含量（区分能力强且峰面积较大的色谱峰）的影响，结果见表3～表6。从表3 可知，当其他因素固定不变，电子鼻测得的主要成分含量会随着进气量的变化而变化，当进气量为250 mL·min-1时可得到最佳主要成分含量和最小偏差，故后续研究最佳进气量确定为250 mL·min-1。同理，由表4～表6 可以分别得到最佳放置时间15 min、最佳称样量3 g、最适颗粒度60目。

表3 进气量对秦艽样品主要成分质量分数的影响（±s,n=3）

表3 进气量对秦艽样品主要成分质量分数的影响（±s,n=3）

注：不同字母代表P＜0.05，表4～表6同。

表4 放置时间对秦艽样品主要成分质量分数的影响（±s,n=3）

表4 放置时间对秦艽样品主要成分质量分数的影响（±s,n=3）

表5 称样量对秦艽样品主要成分质量分数的影响（±s,n=3）

表5 称样量对秦艽样品主要成分质量分数的影响（±s,n=3）

表6 颗粒度对秦艽样品主要成分质量分数的影响（±s,n=3）

表6 颗粒度对秦艽样品主要成分质量分数的影响（±s,n=3）

3.2 PCA区分不同种的秦艽

PCA 是一种多元统计方法，在一定程度上可以实现多指标数据的转换和降维，并对其结果进行线性分类，最终呈现二维/三维图。本研究采用的PCA可以在没有任何样品信息的情况下，迅速浏览所有数据，筛选出其中区分能力强（discrimination power＞0.900）、峰面积大（range＞1000）且分离效果较好的色谱峰作为传感器，进行PCA，最终建立模型。采用3.1 项建立的秦艽的最佳检测方法对不同产地的秦艽进行检测，然后将气味数据调入电子鼻自带的Winmuster 1.6.2 软件中，选取在5～53 s 平稳时间段的数据进行分析，结果见图2。图2结果显示，第一主成分（PC1）方差贡献率为88.24%，第二主成分（PC2）方差贡献率为9.05%，PC1和PC2累积方差贡献率为97.29%，基本代表秦艽所有电子鼻特征信息。PCA 能够较好区分6 种秦艽，彼此之间无重叠，且整体的最低区分度也达到了70%以上，表明不同种的秦艽之间存在较大差异。6 种秦艽样品中与其他样品的区分度最高者为黄管秦艽，与其他5 种秦艽区分度都达到了95%以上，最高达到了99.7%；秦艽和小秦艽样品的数据分散，不够稳定，虽未重叠，但其之间差异相距较近，说明传感器对其响应值较小，由此可知其所含成分的含量相近，不易区分。总体来看，6种秦艽样品聚类区分的结果显示不同种秦艽之间气味差异较明显。

图2 不同产地秦艽的PCA

3.3 LDA区分不同种的秦艽

LDA 是一种常用的分类方法，应用该方法需要样本空间呈正态分布，并有相等的离差。构造的判别函数由原始变量经线性组合得出，能够最大限度地区分不同的样本集，在降低数据空间维数的同时最大限度地减少信息丢失。这种数学分类规则可将N维空间分成子空间，并从而将其定义在直线、平面或超平面上。这种计算判别函数的方法可以使组间变异与组内变异的比率达最大。

由图3可知，LDA 中判别式1和判别式2的方差贡献率分别为54.98%和41.05%，两判别式的累积方差贡献率为96.03%。运用LDA可以使6个种的秦艽完全分开而不与其他的有重叠，且较PCA 区分效果更好，表明LDA 更适合对不同种的秦艽进行区分，因此后续采用LDA 对同种秦艽的不同产地进行区分。

图3 LDA对不同种秦艽的区分

3.4 LDA区分不同产地的粗茎秦艽

由图4 可知，8 个产地的粗茎秦艽有4 个产地的可以很好地与其他产地样品区分来，其中C2、C3、和C8 均为云南省不同州的粗茎秦艽的栽培品，而C6 为甘肃和政的野生粗茎秦艽，由此可以分析，云南省不同州栽培的秦艽品质存在较大差异，可能与各地的栽培方式以及环境条件有关；C6 为野生资源，可以看出其与另外7 个样品相距较远，证明了野生秦艽与栽培品之间的差异性，也验证了野生资源的不可替代性。C1、C4、C5 和C7 间有重叠，无法分开，说明其气味十分相近，可能是生长海拔相近所致，说明海拔对秦艽化学成分的生成有一定影响。

图4 LDA区分不同产地的粗茎秦艽

由图5 可以看出，LDA 对大叶秦艽的区分效果较好，11 个产地的样品有5 个不能很好地分开，其余6 个样品都达到了较好的分离度。不同产地的大叶秦艽较粗茎秦艽质量差异更大，可能是因为大叶秦艽的生长环境条件要求更严格，所以产地变化对其所含的成分的含量有较大影响，所以电子鼻可以很好地区分开。D2 和D9 有交集，区分效果欠佳，但D6 和D7 几乎完全重叠，说明电子鼻中传感器对其气味响应敏感程度一致，不能区分，可能是因为产地相邻，且海拔相近，所以生物气味也相同，又因为D7 和D8 为野生资源，D6 为一等品，可得出栽培品中的一等品与野生资源中的挥发性成分相近，说明人为分出的等级是合理的，即对秦艽进行等级划分是有必要的。

图5 LDA对不同产地大叶秦艽的区分

由图6可知，LDA 对不同产地麻花艽进行分析，第一判别式的方差贡献率为78.15%，第二判别式的方差贡献率为13.76%，累积方差贡献率达91.91%。LDA 对麻花艽的区分度很高，6 个产地的都可以被完全分开，只有M4 和M8 没有分开，可能是由于这2 个产地的人工栽培条件或者自然生长条件类似，以致这2 个产地的秦艽气味相似，电子鼻无法将其区分开。

图6 LDA对不同产地麻花艽的区分

由图7、图8 可知，运用LDA 分析不同产地黄管秦艽、小秦艽都可以完全区分开，且相对于样本量较大的粗茎秦艽、麻花秦艽等区分度更高，由此可知，电子鼻对小容量样品区分更好。黄管秦艽与小秦艽都为3 个样本，但是秦艽比小秦艽区分度高，因为秦艽的产地差别大，可能所含成分差别大，而小秦艽都产自甘肃，气味较相似，表明了电子鼻对不同产地的秦艽区分准确性好。

图7 LDA对不同产地小秦艽的区分

图8 LDA对不同产地黄管秦艽的区分

3.5 Loadings区分不同产地的秦艽

由图9 可知，1 号、2 号、9 号即W1W、W2W、W5S 传感器对模式识别影响较大，对区分不同产地秦艽样品的贡献率最大，由此得出秦艽中所含芳香类成分和氮氧化合物含量较其他成分多。W1S、W2S、W1C、W6S、W3S 传感器几乎无响应，贡献率低，趋近于0。3 号和8 号即W5C 和W3C 具有相似的负载因子。

图9 Loadings传感器贡献率分析

4 结论与讨论

由于电子鼻技术对秦艽的气味响应灵敏、稳定，故本研究考察了电子鼻响应值及进气量、放置时间、称样量、颗粒度对秦艽样品的区分度的影响，最终确立了电子鼻技术对秦艽最佳的样品前处理条件，可以用于区分不同种、不同产地的秦艽样品。

本研究主要采用LDA、PCA、Loadings 3 种分析方法对秦艽样品的电子鼻的结果进行分析，结果显示，LDA 较PCA 更适合秦艽的产地鉴定。Loadings 分析可得秦艽中芳香类成分和氮氧化合物含量较高，与化学鉴定结果一致。与现有研究相比[31]，算法的多样性增加了实验的可靠性及准确性，因此，电子鼻技术可以准确区分不同种的秦艽，对于同种不同产地的秦艽的区分样本容量越小其区分能力越强，准确度越高；秦艽的产地、生长地海拔高度、栽培方式等都会影响电子鼻对其的区分，产地距离越近越不易区分，反之则区分度越高；海拔相差越大，电子鼻对其区分越好；野生资源与人工栽培品之间差异大，更容易区分。

中药具有的气味是评价其质量的主要依据之一，也是其真伪及产地鉴别的重要依据[32-33]。当前对中药材的鉴别大多是传统的鉴别方法，在中药真伪鉴别中的应用较为广泛，但在不同产地药材之间的鉴别中存在一定的困难。另外，现代技术如薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）及GC-质谱法（MS）等在中药的鉴别上应用广泛，但由于样品前处理过程复杂，费用高昂、污染环境等问题也逐渐显现出来，而且这些技术往往是针对单一成分或几类成分的定性、定量研究。与之相比，电子鼻技术在分析样品时过程相对简单，分析速度快，并且是对样品“气味”的整体性研究。所以，电子鼻技术在中药的鉴别中有很好的应用价值。本研究结果表明，电子鼻可用来区分不同产地甚至不同栽培方式的秦艽，避免了使用各种有机溶剂造成的环境污染，人体主观因素及其他因素造成的对秦艽产区、栽培方式的误判，也可防止相似的药材混淆和冒充。此项研究为电子鼻用于秦艽产地和秦艽栽培方式的鉴别提供了新思路和方法。

甘肃、青海、四川、山西、陕西、宁夏为秦艽样本分布较多的省域，本研究所采用的秦艽样本整体分布区域较广泛，考虑到了不同省域不同地区样本的差异性，以及同一样本不同生态型（野生与栽培）的差异性。由于秦艽个别种本身分布区域小，获取样本量有限，导致个别实验分析缺乏一定的指导性，有待进一步深入研究