SOX4在下咽癌中的表达及其对癌细胞恶性生物学行为的影响

张晓波 刘慧婷 刘元茹 左凡 王志霞 任倩倩 姚瑶 陈艳 高骞 盛菊萍 张振新

[摘   要]   目的：分析下咽鳞状细胞癌（hypopharyngeal squamous cell carcinomas，HSCC）组织中SRY相关HMG-box转录因子4（SRY-box transcription factor-4，SOX4）的表达及其与患者临床病理特征及预后的关系。观察siRNAs敲低FaDu人咽鳞癌细胞中SOX4表达对细胞增殖、迁移及裸鼠成瘤的影响。方法：（1）选取下咽癌石蜡切片标本76例，癌旁正常组织标本18例作为对照，采用免疫组化检测SOX4和Ki67的表达水平。（2）选取6对新鲜的下咽癌组织和相邻正常组织，采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测SOX4表达水平。（3）运用siRNAs敲低FaDu细胞中SOX4表达。（4）饥饿释放实验检测SOX4在增殖期FaDu细胞中的表达水平，CCK-8法检测FaDu细胞增殖活性，流式细胞术检测细胞周期的分布，Transwell试验和划痕实验检测细胞迁移能力。（5）Western blot检测上皮间充质转化（epithelial mesendyinal transition，EMT）相关分子的表达。（6）裸鼠成瘤实验观察SOX4对肿瘤生长的影响。结果：（1）与癌旁正常组织相比，HSCC组织中SOX4表达明显升高，与肿瘤分化程度、肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移及Ki67表达相关（P＜0.05）。（2）SOX4高表达患者生存期較短。（3）增殖期FaDu细胞SOX4和PCNA的表达同步明显增加。（4）SOX4-Si2处理后FaDu细胞中SOX4染色强度显著降低，细胞增殖能力明显下降，细胞停滞于G1期，S期细胞减少。（5）SOX4-Si2干扰后FaDu细胞划痕愈合能力明显下降，细胞迁移数减少，上皮表型标志物β-连环蛋白和E-钙粘蛋白表达显著增加，而间质表型标志物波形蛋白和N-钙粘蛋白表达显著降低。（6）裸鼠成瘤实验显示，SOX4-Si2干扰后裸鼠肿瘤生长受到显著抑制，Ki-67阳性率增高。结论：SOX4在HSCC中过表达，SOX4在体内外对下咽癌的进展和迁移起着重要作用，可作为下咽癌患者诊断和治疗的分子靶标。

[关键词]   下咽鳞状细胞癌；FaDu细胞；SOX4；上皮间充质转化；动物模型

[中图分类号]   R739.63 [文献标志码]   A [DOI]   10.19767/j.cnki.32-1412.2023.03.002

The expression of SOX4 in hypopharyngeal carcinoma

and its effect on biological behavior of cancer cells

ZHANG Xiaobo1，2， LIU Huiting3， LIU Yuanru1， ZUO Fan4， WANG Zhixia1，

REN Qianqian1， YAO Yao1， CHEN Yan5， GAO Qian6， SHENG Juping1， ZHANG Zhenxin1

（1Departments of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery， 4Department of Stomatology， Affiliated Hospital of Nantong University， Jiangsu 226001; 2Departments of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery， Jiangyin Peoples Hospital;

3Departments of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery， Affiliated Kunshan Hospital of Jiangsu University;

5Departments of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery， Xiangya Changde Hospital; 6Departments of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery， Traditional Chinese Medicine Hospital of Kunshan）

[Abstract]   Objective： To investigate the expression of SOX4 in hypopharyngeal squamous cell carcinoma （HSCC） tissues and the relationship between SOX4 expression level and clinicopathological features and prognosis. In vivo experiments， using siRNAs to knockdown the expression of SOX4 in FaDu human hypopharyngeal squamous cells， to explore the effect on cell proliferation， migration and tumor formation in nude mice. Methods： （1）Using immunohistochemistry to detect SOX4 and Ki-67 expression in 76 cases of paraffin-embedded HSCC and 18 cases of para-cancerous tissue samples. （2）Using western blot to examine SOX4 expression in 6 fresh pairs of HSCC cancer tissues and adjacent normal tissues. （3）SOX4-siRNAs were used to knockdown the expression of SOX4 in HSCC cell line FaDu. （4）Serum-starving experiment was used to determine expression level of SOX4 in proliferating FaDu cells. Cell viability， cell cycle and cell migration were assessed by CCK-8， flow cytometry， and wound-healing and transwell assays. （5）Using western blot to detect the expression of epithelial mesenchymal transition （EMT） related molecules. （6）Nude mice subcutaneous xenografts experiment was performed to investigate the effect of SOX4 on tumor growth. Results： （1）Compared with para-cancerous tissues， SOX4 expression significantly increased in HSCC specimens and its expression level was associated with differentiation， tumor size， clinical stage， lymph node metastasis and Ki-67 expression （P＜0.05）. （2）The survival time of patients with high SOX4 expression was shorter. （3）The expression of SOX4 and PCNA in FaDu cells increased significantly during proliferating phase. （4）After SOX4-Si2 treatment， the SOX4 staining intensity in FaDu cells decreased significantly， the cell proliferation ability decreased， the cells stagnated in G1 phase， and the cells in S phase decreased. （5）After SOX2-Si2 interference， the scratch healing ability of FaDu cells significantly decreased， the cell migration number decreased， and the expression of β-catenin and E-cadherin which were epithelial phenotype markers increased， while the expression of vimentin and N-cadherin which were interstitial phenotype markers significantly decreased. （6）The tumor formation experiment of nude mice showed that the tumor growth of nude mice was significantly inhibited after SOX4-Si2 interference， and the positive rate of Ki-67 increased. Conclusion： SOX4 is overexpressed in HSCC and plays an important role in the progression and migration of HSCC in vitro and vivo. It can be used as a molecular target for diagnosis and treatment of HSCC.

[Key words]   hypopharyngeal squamous cell carcinoma; FaDu cell; SRY-box transcription factor-4; epithelial mesenchymal transition; animal model

下咽鳞状细胞癌（hypopharyngeal squamous cell carcinomas，HSCC）占所有头颈部鳞状细胞癌3％～5％，近年来其发病率呈逐年上升趋势[1]。超过75％HSCC患者诊断时疾病已处于晚期，局部和远处转移率较高，预后较差，5年总体生存率为15％～45％[2-4]。早期诊断和治疗对降低HSCC死亡率非常关键。深入研究HSCC发生发展机制，寻找用于早期检测和开发新治疗方案的标志物具有重要意义。转录因子家族成员SOX4编码由474个氨基酸组成的分子量为47 kD的蛋白质，SOX4包含四个主要部分：HMG盒（DNA结合结构域）和TAD（反式激活结构域），在中心部位还有一个富含甘氨酸的区域和一个富含丝氨酸的区域[5-6]。已证实SOX4在胚胎发育、细胞命运决定和分化中发挥重要作用。SOX4参与抑制肿瘤细胞凋亡，诱导细胞迁移和转移以及癌症干细胞的产生和维持[7-8]。本研究选取南通大学附属医院病理科2009年1月—2022年10月76例HSCC组织和18例癌旁正常组织石蜡标本，6对新鲜HSCC组织及其相邻正常组织以及FaDu人咽鳞癌细胞株，旨在探索SOX4在HSCC中的表达及其对癌细胞恶性生物学行为的影响。

1   材料与方法

1.1   对象与材料   （1）组织标本：76例HSCC组织石蜡标本，患者术前未作放化疗，均经病理确诊，以同期18例癌旁正常组织石蜡标本作为对照。同时收集手术切除的6对新鲜HSCC组织及其相邻正常组织，存储于-80 ℃低温冰箱保存。本研究经南通大学附属医院医学伦理委员会批准，并获得患者或其家属知情同意。（2）FaDu人咽鳞癌细胞株：购自中国科学院上海细胞库，采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，于37 ℃，5%CO2培养箱中培养。（3）6周龄雄性BALB/C无胸腺裸鼠由南通大学动物实验中心提供和饲养。

1.2   实验方法

1.2.1   免疫组化（immunohistochemistry，IHC）检测HSCC组织中SOX4表达：组织石蜡切片常规烤片、二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化。置于枸橼酸缓冲液（pH 6.0）中煮沸15～20 min，冷却至室温，PBS冲洗3次。切片置于3%H2O2，37 ℃ 15 min，阻断内源性过氧化物酶。以羊血清工作液封闭，37 ℃ 40 min。滴加一抗，4 ℃冰箱过夜。滴加生物素标记二抗，37 ℃孵育30 min。滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min。DAB染色，自來水冲洗后苏木素复染，常规脱水、透明、干燥，中性树脂封片。评分标准：400倍显微镜观察细胞染色情况。染色细胞百分比为A类评分，0～4％计0分， 5％～25％计1分，26％～50％计2分，51％～75％计3分，76％～100％计4分。染色强度为B类评分，阴性计0分，弱阳性计1分，中等阳性计2分，强阳性计3分。A×B为IHC最终得分，0～5分为低表达或不表达，6～12分为高表达。

1.2.2   Western blot印迹法：采用Western blot检测SOX4、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、β-连环蛋白（β-catenin）、E-钙粘蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、N-钙粘蛋白（N-cadherin）表达量。称取适量HSCC组织或癌旁组织，碾碎，加入RIPA裂解液，置于冰上20 min。将裂解产物移至EP管中，4 ℃下离心取上清液。加入loading buffer，沸水煮15 min后置于-80 ℃冰箱备用。FaDu细胞蛋白提取方法同组织蛋白提取。根据目的蛋白分子量选定分离胶浓度为10%，制备SDS-PAGE凝胶，在电泳液中进行电泳。组装转膜夹层，在预冷的转膜液中转膜。转膜结束后将PVDF膜移至含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中，室温下摇床均匀封闭2 h。用含5%脱脂奶粉的TBS缓冲液稀释一抗，4 ℃孵育过夜。取出湿盒室温复温40 min，TBST洗膜3次。TBS稀释二抗，室温下孵育1 h。TBST洗膜3遍。膜在暗房加入ECL试剂，胶片曝光、显影，定影后扫膜备用。利用Image J软件计算条带的灰度值。

1.2.3   细胞转染：（1）取生长良好的FaDu细胞种植于6孔板培养，待细胞密度达50%左右时进行转染。分为转染组、空转组及对照组，转染组根据SOX4敲低位点不同分为Si1、Si2、Si3、Si4四组。（2）配置转染试剂：2支EP管中分别加入A液（10 μL siRNA+240 μL基础培养基）、B液（5 μL Lipofectamine 2 000+245 μL基础培养基），混合后静置5 min。将B液加入A液中充分混合，静置20 min。6孔板中加入新鲜无血清基础培养基1 500 μL，再加入AB混合液。（3）4～6 h后换上含10%胎牛血清的完全培养基。（4）48 h后提取细胞RNA，72 h后提取细胞蛋白，利用RT-qPCR及Western blot印迹法检测转染效率。

1.2.4   血清饥饿释放实验：取生长良好的FaDu细胞于无血清DMEM高糖培养基培养72 h后，换成含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，分别培养0 h、6 h、12 h、24 h、36 h。收集各组细胞，采用流式细胞术和Western blot印迹法检测细胞周期、SOX4蛋白和PCNA蛋白表达水平。

1.2.5   RT-qPCR技术检测SOX4 mRNA表达：（1）提取总RNA：FaDu细胞转染48 h后，以无菌PBS清洗2次，每孔加入1 mL Trizol充分裂解，将裂解产物移至去RNA酶EP管中，加入0.2 mL氯仿震荡15 s。4 ℃下12 000 r/min离心15 min，吸取无色上层液至另一支去RNA酶EP管，加入0.5 mL异丙醇，混匀，静置10 min，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，弃上清。每管加入1 mL DEPC水配置的75%乙醇，4 ℃下7 500 r/min离心5 min，弃上清。室温中晾干，每管加入20 μL DEPC水溶解，测定样品RNA浓度。（2）逆转录合成cDNA：去RNA酶EP管中分别加入Oligo（dT）1 μL，RNA（0.1～5 μg）加DEPC水11 μL，70 ℃ 5 min，立即冰上冷却。加入核糖核酸酶抑制剂1 μL，dNTPmix（10 mmol/L）2 μL，5×Reactin Buffer 4 μL，混匀，再加入1 μL逆转录酶。42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min终止反应，即刻置于-20℃ 保存。（3）实时荧光定量PCR（RT-qPCR）：引物序列为SOX4 F：5-CACTCCTCCTCTTCCTCCTC-3，R：5-GCCGA-

CGACGAACTGAAG-3；GAPDH F：5-CAGACTATCAAGGAGGAAG-3，R：5-CCAGGAGTGAGATG-

ATTC-3。反应体系：cDNA（1 ∶ 20）2 μL，上、下游引物2 μL，SYBR Green PCR Master：Mix 10 μL、H2O 6 μL，总体系20 μL。反应条件：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环40次。每组设3个复孔。

1.2.6   流式细胞术分析细胞周期分布：收集生长良好的FaDu细胞，4 ℃ PBS清洗3遍，胰酶消化后制成细胞悬液。4 ℃下1 200 r/min离心5 min，弃PBS，重复2次。加入预冷70%乙醇1 mL固定细胞24 h。取出细胞1 200 r/min离心5 min，弃去乙醇，预冷PBS洗涤3次，每管加入1%Triton X-100 200 μL 10 min。再加入RNaseA（100 μL/mL）100 μL，4 ℃避光反应20 min。每管加入200 μL PI染色试剂（0.5 mg/mL），冰上染色20 min。流式细胞仪（激发波长488 nm）分析细胞周期分布。

1.2.7   CCK8法检测细胞增殖能力：将FaDu细胞种入96孔板，每孔约8 000个细胞。细胞转染后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h吸净孔中培养基，每孔加入10 μL CCK8试剂+90 μL基础培养基混合液，孵育90 min，酶标仪检测490 nm处OD值。

1.2.8   划痕实验检测细胞迁移能力：将FaDu细胞种入6孔板中，待细胞融合80%左右进行细胞转染，分为转染组、空转组和对照组。用10 μL枪头对每孔划“井”字，以无菌PBS洗去划落细胞，每孔加入无血清DMEM高糖培养基培養。分别于转染后0 h、36 h在显微镜下拍照。

1.2.9   Transwell实验检测细胞迁移能力：将FaDu细胞种入6孔板中进行细胞转染，分为转染组、空转组和对照组。取24孔板，每孔加入500 μL含10%胎牛血清的完全培养基，将小室置入孔中。用胰酶消化转染48 h的细胞，制成单细胞悬液，将5×104个细胞/200 μL加入上室中。36 h后PBS洗涤细胞2次，棉签擦洗干净上室。外室中每孔加入多聚甲醛固定30 min。小室晾干后置入结晶紫染色20 min，自来水冲洗干净，晾干。显微镜下观察、拍照，随机选取5个视野统计细胞个数。

1.2.10   裸鼠成瘤实验：裸鼠分为NC组和干扰组，每组5只。干扰组裸鼠肩部皮下注射2×106个SOX4-Si2处理的FaDu细胞，NC组注射相同数量的转染空载质粒的Fadu细胞。每3天用游标卡尺测量肿瘤体积，体积=0.5×长度×宽度2。注射后3周处死小鼠，甲醛固定肿瘤组织进行病理学分析。实验重复3次。本实验经南通大学动物实验伦理委员会批准。

1.3   统计学处理   应用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析。计数资料以频数表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以x-±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析。SOX4与Ki67表达的相关性采用皮尔森相关性分析，绘制Kaplan-Meier生存曲线，采用log-rank分析SOX4表达与患者预后的关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

2   结      果

2.1   SOX4蛋白在HSCC组织中过度表达   石蜡标本免疫组化显示，SOX4蛋白表达定位于细胞质和细胞核中，在HSCC组织中高表达（IHC评分6.50±2.93分），在癌旁正常组织中弱表达（IHC评分2.00±1.61分），差异有统计学意义（P<0.001）（图1A、B）。Western blot检测6对新鲜HSCC组织及其癌旁正常组织，结果显示HSCC组织中SOX4表达水平明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1C、D）。

2.2   SOX4表达与下咽癌患者临床病理特征及预后的关系   如表1和图2所示，低分化型HSCC SOX4表达高于高分化型（P=0.002，图2A、B），III～IV期患者SOX4表达高于I～II期患者（P<0.001，图2C），淋巴结转移患者SOX4表达高于无淋巴结转移患者（P<0.001，图2D），肿瘤直径＞2 cm患者SOX4表达高于≤2 cm患者（P=0.006，图2E），差异均有统计学意义；而不同年龄（P=0.872）和性别（P=0.222）间SOX4表达水平的差异均无统计学意义（P＞0.05）。Ki-67是细胞增殖相关核抗原，是评估肿瘤增殖细胞比例的有效工具。皮尔森相关性分析表明SOX4表达越高，Ki-67阳性率越高（R2=0.569，P<0.001，图2F、G）。对HSCC患者随访至2022年10月，Kaplan-Meier生存分析显示，SOX4高表达（IHC评分≥6分）患者生存期较短，预后较差（P=0.026，图2H）。

2.3   SOX4在增殖期FaDu細胞中的表达   将FaDu细胞血清饥饿72 h后，将血清加入培养基中培养6、12、24和36 h，流式细胞术检测显示G1期细胞从86.33％降至46.61％，S期细胞从9.85％增至37.43％（图3A）。Western blot检测显示，增殖期FaDu细胞SOX4和PCNA（细胞增殖标志物）的表达同步明显增加（P＜0.05）（图3B、C）。

2.4   敲低SOX4表达抑制FaDu细胞增殖能力   利用siRNAs转染FaDu细胞以敲低SOX4的表达，PCR和Western blot技术检测FaDu细胞中SOX4 mRNA及蛋白表达，证实敲低效果良好，其中以SOX4-Si2的效果最好（图4A、B、C）。后续相关实验采用SOX4-Si2处理的FaDu细胞。IHC染色结果表明，SOX4-Si2处理后FaDu细胞中SOX4染色强度显著降低（图4D）。CCK-8检测结果显示，与NC-Si或对照组相比，SOX4-Si2敲低后的FaDu细胞增殖能力明显下降（图4E）。流式细胞术分析显示，敲低SOX4表达后导致FaDu停滞于G1期，S期细胞减少（图4F、G）。

2.5   敲低SOX4表达抑制FaDu细胞迁移能力   划痕实验显示，SOX4-Si2干扰后FaDu细胞划痕愈合能力较对照组明显下降（P＜0.05）（图5A、B），Transwell实验也显示SOX4-Si2干扰后FaDu细胞迁移数少于Control和NC-Si组（P＜0.05）（图5C、D），表明敲低SOX4后FaDu细胞迁移能力明显下降。同时上皮表型标志物β-catenin和E-cadherin表达显著增加，而间质表型标志物vimentin和N-cadherin表达显著降低（图5E、F），表明HSCC中SOX4可能通过诱导上皮间充质转化（epithelial mesendyinal transition，EMT）而促进肿瘤转移。

2.6   动物模型实验中敲低SOX4表达抑制肿瘤生长   裸鼠成瘤实验显示，与NC组相比，SOX4-Si2干扰后肿瘤生长受到显著抑制（P＜0.001）（图6A、B）。此外，免疫组化染色显示在SOX4表达增高的同时，增殖标志物Ki-67阳性率也增高（图6C）。提示敲低HSCC细胞中的SOX4可以抑制体内肿瘤生长。

3   讨      论

本研究IHC和Western blot检测显示，HSCC组织中SOX4蛋白表达明显高于癌旁组织，其表达水平与肿瘤细胞分化程度、临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移及Ki-67表达有关，这与鼻咽癌[9]、前列腺癌[10]、口腔鳞状细胞癌[11]等恶性肿瘤相似。在非小细胞肺癌[12]、前列腺癌[13]、胆管癌[14]、口腔癌[11]中SOX4高表达预示患者预后不良，本研究发现SOX4高表达患者生存期较短，预后较差，提示SOX4可能是预测HSSC患者预后的生物学标志物。

由于异常增殖是细胞恶性转化的重要环节，我们首先检测增殖期FaDu细胞中SOX4表达水平，Western blot检测显示，增殖期FaDu细胞中SOX4和细胞增殖标志物PCNA的表达同步明显增加，说明SOX4过表达与肿瘤生长密切相关。使用siRNA敲低FaDu细胞中SOX4的表达，细胞增殖能力显著降低，S期细胞显著减少，提示SOX4可能通过调节细胞周期进程来促进肿瘤细胞增殖。

转移是癌症发病中最复杂的分子调控过程[15]，研究表明SOX4高表达与肿瘤复发、远处转移和侵袭性有关[16]。EMT的程序化激活使肿瘤细胞获得间充质特征，有利于肿瘤的进展、转移和复发。许多上皮来源的恶性肿瘤过表达SOX4，并且与EMT的发展有关[17]。SOX4对肿瘤细胞迁移的影响可能与不同信号通路的激活有关。有报告认为，癌症的进展与TGF-信号通路有关[18-19]。SOX4参与HCC细胞转移过程中的EMT，从而促进肿瘤进展[20]。在人乳腺上皮细胞中TGF-β介导的SOX4表达增强对EMT期间产生间充质表型是必要的[21]。SOX4过度表达有助于乳腺癌细胞的侵袭和扩散，SOX4过度表达与生成EMT的TGF-β途径激活有关。本研究发现，沉默SOX4表达后FaDu细胞迁移能力受到抑制，同时上皮标志物表达增加，间质标志物表达降低，提示SOX4可能通过协同EMT促进HSCC转移。

综上所述，SOX4在HSCC中过表达，SOX4促进HSCC细胞的迁移和增殖，可能是早期识别HSCC、判断患者预后的生物标志物和治疗靶点。

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[收稿日期] 2023-03-08

（本文編辑   王晓蕴）