不同非病毒载体对原代肌腱细胞转染效率和毒性作用研究

金静 杨纤纤 周友浪

[摘   要]   目的：研究并比较非病毒载体纳米球和脂质体对原代肌腱细胞的转染效率以及毒性作用。方法：制备不同N/P比例的PLGA纳米球，原代培养鸡、大鼠、小鼠肌腱细胞，将低、中、高不同剂量的pEGFP-N1质粒负载于纳米球和脂质体，对三种肌腱细胞进行转染。通过荧光拍照和流式细胞分析，检测质粒在24、48、72、96 h的转染效率，Western Blot法检测GFP表达水平，CCK8法检测转染24、48、72 h细胞活力。结果：对于鸡肌腱细胞，纳米球的转染效率显著高于脂质体，尤其是NP10的GFP表达最明显，且对细胞无毒性作用。对于大鼠肌腱细胞，NP10的轉染效率最佳，其次是NP6和脂质体，但脂质体降低了细胞活性。对于小鼠肌腱细胞，纳米球和脂质体的转染效率均较低，且随着时间与剂量的增加，细胞毒性作用越来越明显。结论：NP10是鸡和大鼠肌腱细胞转染质粒的最佳试剂，但小鼠肌腱细胞最合适的转染试剂还需进一步探索。

[关键词]   非病毒载体；纳米球；脂质体；质粒；原代肌腱细胞

[中图分类号]   Q2-33 [文献标志码]   A [DOI]   10.19767/j.cnki.32-1412.2023.03.001

Study on the transfection efficiency

and toxicity of primary tendon cells by different non-viral vectors

JIN Jing1，2， YANG Qianqian1， ZHOU Youlang1

（1Clinical Medical Research Center， Affiliated Hospital of Nantong University， Jiangsu 226001;

2School of Medicine， Nantong University）

[Abstract]   Objective： To investigate and compare the transfection efficiency and toxicity of non-viral vector nanoparticles and liposomes on primary tendon cells. Methods： PLGA nanoparticles with different NP ratios were prepared， and the tendon cells of chicken， rat and mouse were cultured. The low， medium and high doses of pEGFP-N1 plasmid were loaded into nanoparticles and liposomes， and the three cells were transfected. The transfection efficiency of the plasmid at 24， 48， 72 and 96 hours was detected by fluorescence photography and flow cytometry. The expression level of GFP was detected by Western Blot， and cell activity was detected by CCK8 at 24， 48 and 72 hours after transfection. Results： For chicken tendon cells， the transfection efficiency of nanoparticles was significantly higher than that of liposomes， especially the GFP expression of NP10 was the most obvious， and it was not toxic to cells. For rat tendon cells， NP10 had the best transfection efficiency， followed by NP6 and liposomes， but liposomes reduced cell activity. For mouse tendon cells， the transfection efficiency of nanoparticles and liposomes was low， and the toxic effect on cells became more and more obvious with the increase of time and dose. Conclusion： NP10 is the best transfection reagent for plasmid transfection in chicken and rat tendon cells， but the most suitable transfection reagent for mouse tendon cells needs further exploration.

[Key words]   non-viral vector; nanoparticle; liposome; plasmid; primary tendon cell

肌腱发生损伤后一般通过外源性愈合和内源性愈合进行组织修复，外源性愈合主要由腱鞘和滑膜的成纤维细胞、滑膜细胞等侵入损伤部位，内源性愈合是内部成纤维细胞等直接作用于肌腱断端。过多的外源性愈合通常会导致粘连形成，影响肌腱滑动功能的恢复，因此，增强内源性愈合是促进肌腱愈合并减少粘连的重要途径[1-2]。由于肌腱内源性细胞稀少，近年来基因治疗肌腱损伤逐渐受到关注。将生长因子基因转入肌腱细胞中，可持续、高效翻译出有利于肌腱细胞生长的生长因子，进而促进肌腱内源性修复[3-5]。基因治疗中载体主要包括病毒载体与非病毒载体，考虑到生物相容性和伦理问题，目前非病毒载体被广泛研究，其中脂质体是一种较为成熟的非病毒载体，已证实在多种细胞中具有较高的转染效率[6]。

本课题组研发的非病毒载体PLGA纳米球具有缓慢释放和生物相容性高的优势，并在鸡、大鼠的肌腱细胞中成功转染质粒、siRNA等[7-9]。本文拟比较三种PLGA纳米球（NP6，NP8，NP10）和脂质体（Lipo）对三种常用动物（鸡、大鼠、小鼠）肌腱细胞转染质粒的效率以及毒性的影响，探索转染质粒效率最高、毒性最小的转染试剂，以促进基因治疗在肌腱修复中的进一步应用与发展。

1   材料与方法

1.1   转染试剂及pEGFP-N1质粒的制备   通过复乳法获得纳米球，将200 mg 聚（D，L-丙交酯-co-乙交酯）溶解于2 mL二氯甲烷，然后将之缓慢滴加在6 mL的7%（w/v）聚乙烯醇（PVA）（Sigma-Aldrich，美国）溶液中，使用超声仪（Bandelin electronic，德国）超声处理60 s以产生初级乳液。将初级乳液添加到100 mL 1%（w/v）PVA溶液中，再次超声处理180 s以形成双乳液，在室温下搅拌24 h挥发二氯甲烷。13 000 r/min离心5 min，分离PLGA纳米颗粒，去离子水洗涤2次。按不同N/P比（聚乙烯亚胺基摩尔数/质粒磷酸基摩尔数）得到NP6，NP8和NP10纳米球。脂质体（ThermoFisher LL3000015，美国）。pEGFP-N1载体由上海吉凯基因医学科技股份有限公司构建，其携带的增强型绿色荧光蛋白（GFP）基因可以检测不同转染试剂对肌腱细胞的转染效率。

1.2   原代肌腱细胞培养   使用PBS缓冲液配制浓度为1 mg/mL的Ⅰ型胶原酶（索莱宝科技有限公司，中国）溶液，过滤后存于4 ℃待用。动物处死后，在超净台下用无菌器械取下肌腱组织，PBS清洗6次。组织剪碎后置于Ⅰ型胶原酶溶液中，在细胞培养箱中消化2 h。细胞筛过滤细胞悬液，1 000 r/min離心5 min获取细胞沉淀，以DMEM高糖培养基（含10%胎牛血清）重悬细胞，用于后续实验。

1.3   细胞转染   将肌腱细胞接种于24孔板，待细胞融合度为70%左右时，将低、中、高（1 μg/孔、2 μg/孔、3 μg/孔）三种剂量的N1质粒分别负载于纳米球（1 μL/孔、2 μL/孔、3 μL/孔），室温孵育15 min后加入到细胞上清中，N1质粒与脂质体的结合按试剂说明书操作。所有孔均在转染后24 h换液，并在转染24 h、48 h、72 h和96 h进行荧光拍照及转染效率检测。与24孔板转染方法相同，将细胞接种于96孔板，根据孔径底面积的大小，将低、中、高（0.2 μg/孔、0.4 μg/孔、0.6 μg/孔）三种剂量的N1质粒通过纳米球（0.2 μL/孔、0.4 μL/孔、0.6 μL/孔）和脂质体转染至细胞中，分别在转染24 h、48 h和72 h三个时间点检测细胞活性。

1.4   转染效率检测   细胞经PBS清洗后置于荧光显微镜下（Leica DMR 3000，德国）观察并拍照（文中每种细胞仅展示纳米球和Lipo转染效率最高的荧光图片），随后用胰酶消化细胞，完培终止消化后，1 000 r/min离心5 min，PBS重悬，使用流式细胞仪（Attune NxT，Invitrogen，美国）检测GFP阳性信号，未转染的细胞作为阴性对照。

1.5   Western Blot法   采用RIPA裂解液在4 ℃下提取2 μg质粒/孔剂量下的细胞蛋白，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白质电泳，然后转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h。以抗兔GFP一抗（1 ∶ 1 000，CST，美国）4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次后，以荧光二抗（1 ∶ 10 000，Lincoln，美国）在室温下孵育2 h，再次清洗膜后，采用奥德赛红外成像系统（LI-COR，Lincoln，美国）扫描并显示出条带，用Image J软件定量蛋白条带的灰度值。

1.6   CCK8法测定细胞活力   完培稀释CCK8浓缩液（诺唯赞公司，中国）配制成1×CCK8溶液，弃细胞上清，每孔加入100 μL 1×CCK8溶液，在细胞培养箱孵育2 h，使用酶标仪（SpectraMax M5，美国）在450 nm激发光波长下读取OD值。

1.7   统计学处理   应用GraphPad软件对数据进行分析处理。计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2   结      果

2.1   鸡肌腱细胞转染效率及细胞活性   由表1可见，1 μg质粒转染24 h时，Lipo转染效率优于NP6、NP8、NP10纳米球，转染72 h时1 μg质粒Lipo转染效率优于NP10纳米球，转染96 h时1 μg质粒Lipo转染效率优于NP10纳米球，3 μg质粒Lipo转染效率优于NP6纳米球。在其他时间和剂量下，NP6、NP8、NP10纳米球对鸡肌腱细胞的转染效率均显著高于Lipo，纳米球转染效率最高达39%左右，Lipo转染效率最高达30%左右。荧光图显示纳米球转染后绿色荧光蛋白明显多于Lipo组（图1A），NP6、NP8、NP10和Lipo均能够促进GFP蛋白的表达，且NP10组GFP蛋白表达量最高（图1B）。CCK8检测结果显示，细胞转染48 h时中剂量NP6和高剂量NP8对肌腱细胞活力产生毒性作用（图1C）。

2.2   大鼠肌腱细胞转染效率及细胞活性   由表2可见，转染24 h时，NP6、NP8、NP10纳米球对鸡肌腱细胞的转染效率均显著高于Lipo。转染48 h、72 h和96 h时，纳米球仅在某些剂量下对细胞的转染效率优于Lipo。但Lipo的最高转染效率仅约14%，而纳米球转染效率可达到25%，因此，纳米球组细胞绿色荧光显著多于Lipo组（图2A）。NP6、NP8、NP10和Lipo均能够显著促进GFP蛋白表达，其中NP10组GFP蛋白表达量最高（图2B）。转染48 h时Lipo组细胞活力较Control组明显降低，表明Lipo对大鼠肌腱细胞有一定毒性作用（图2C）。

2.3   小鼠肌腱细胞转染效率及细胞活性   由表3可见，在相同转染时间和相同剂量下，NP6、NP8、NP10纳米球对小鼠肌腱细胞的转染效率均高于Lipo，尽管部分转染时间与剂量下差异无统计学意义。纳米球和Lipo对小鼠的转染效率均较低，纳米球最高转染效率约11%，Lipo最高转染效率约3.5%，绿色荧光和GFP蛋白的升高均不明显（图3A、3B）。纳米球和Lipo组细胞活力较Control组显著降低，表明纳米球和Lipo对小鼠肌腱细胞有较强的毒性（图3C）。

3   讨      论

由于肌腱内部血供有限和细胞稀少，肌腱组织中内源性生长因子匮乏，导致肌腱在发生损伤后愈合缓慢，常常面临再次断裂的风险。本课题组早期研究证实，通过腺相关病毒（AAV2）转染碱性成纤维生长因子（bFGF）和血管内皮生长因子（VEGF）进入肌腱组织，对肌腱细胞的生长和Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成产生重要作用，促进损伤肌腱的愈合[4-5，10]。尽管病毒类载体具有良好的基因递送效能，但制造过程复杂、成本昂贵，且存在一定的安全风险。

近年来，国际上推出阳离子聚合物基因转染技术，该技术适用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小，转染效率高，其中聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳。在前期研究中我们将bFGF和VEGF质粒负载于PEI修饰的PLGA纳米球上（NP），成功转染鸡的肌腱细胞和肌腱组织，并取得肌腱愈合强度显著增加的疗效[7]。不仅如此，我们将siRNA负载于PEI修饰的PLGA纳米球上，转染细胞或组织后目的基因的表达均下调[11]。

为了进一步推广纳米球的应用，本研究系统比较非病毒载体PLGA纳米球（NP6，NP8，NP10）和脂质体（Lipo）对鸡、大鼠、小鼠肌腱细胞转染质粒的效率及毒性。结果显示，对于鸡和大鼠肌腱细胞，NP10转染N1质粒的效率最高。有趣的是，在雞肌腱细胞中转染效率随着时间的增加而逐渐升高，而在大鼠肌腱细胞中转染效率随着时间的增加而降低，但都不存在明显的剂量依赖性，NP10对细胞也无明显的毒性作用。对于小鼠肌腱细胞，本研究未筛选出最合适的非病毒载体，无论是纳米球还是Lipo，对小鼠肌腱细胞均有显著的细胞毒性，尽管纳米球组的细胞表达少量绿色荧光，但Western Blot实验显示GFP表达并未升高。

综上所述，利用高比例的PEI修饰纳米球NP10能将外源性基因有效转染至鸡和大鼠的肌腱细胞中，NP10作为非病毒载体后续可用于鸡和大鼠肌腱损伤基因治疗的研究。

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[收稿日期] 2023-02-09

（本文编辑   赵喜）