皂荚棘刺提取物总黄酮提取测定、除螨活性及抗氧化活性研究

束成杰，李卓航，陈殿松，马铃，周欣雨，赵婧，王淼，马世宏*

（1.中华全国供销合作总社南京野生植物综合利用研究所，江苏 南京 211111；2.广州德谷个人护理用品有限公司，广东 广州 510800；3.南京师范大学泰州学院，江苏 泰州 225300）

棘刺为豆科植物皂荚（Gleditsia sinensisLam.）的干燥棘刺，又名皂针、天丁、皂角针等等，在我国东北、华北、华东、华南、四川以及贵州等地均有分布，全年可采收，是一种宝贵的中药材［1-2］。其主要成分有黄酮苷、酚类和氨基酸等［3］。《本草纲目》记载：“皂荚刺治风杀虫，功与荚同，但其锐利直达病所为异耳”［4］。研究表明，棘刺具有消肿、抗炎、抑菌、杀菌的功效，并对多种癌症细胞具有一定的抑制作用［5-8］。但目前国内外对于棘刺提取物的研究整体较少，且对药理活性的探究多数集中在抗炎和抗癌方向。

本研究从除螨和抗氧化的角度出发，对棘刺的药理活性进行了探究，为未来的综合开发利用提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

皂荚棘刺（南京野生植物综合利用研究院）；芦丁对照品（上海源叶生物科技有限公司）；粉尘螨（皖南医学院寄生虫教研室提供）；甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯（美国Fisher Scientific公司）；乙醇为分析纯（南京化学试剂有限公司）。

NH-4数显的恒温水浴锅（江苏省金坛市三坛仪器厂）；SHZ-DⅢ 循环式真空泵（巩义市予华仪器责任有限公司）；RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生工仪器厂）；KF-1209型号的电子天平（中国凯丰集团有限公司）；BCD-183A型号冰箱（合肥荣事达有限公司）；高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；FA2004HM式分析天平（万泰仪器有限公司）；TG1650-WS台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；DS-1组织粉碎机（北京华欣科创科技有限公司）；HCB-1300V垂直层流洁净工作台（青岛海尔特种电器有限公司）；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；SPX-150B-Z型生化培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；OlympusBX41奥林巴斯显微镜（南京艾朗仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 棘刺提取物的制备

精确称取10.0 g皂荚棘刺，粉碎后过80目筛，加入120 mL的75%乙醇，放入72℃的水浴锅，回流提取三次，每次90 min，将3次回流提取液合并，将合并后的提取液经离心机离心后减压抽滤，最后将其放至室温条件下静置，所得产物通过减压蒸馏除去乙醇溶剂，补充纯水定容至120 mL，得到皂荚棘刺提取物。

1.2.2 棘刺提取物的黄酮含量测定

色谱条件：流动相为乙腈∶0.25% 磷酸 = 50 ∶50，流速1.0 mL/min，检测波长为360 nm［1］。

绘制标准曲线：准确称取芦丁标准品10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得金丝桃苷及芦丁标准品溶液，稀释成浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的溶液，精密吸取20 µL标准液进样，得线性关系良好的回归方程。

样品配置：将棘刺提取物溶液再次过滤，精密吸取20 µL进样。代入标准曲线公式，计算溶液中的芦丁含量［2］。

1.2.3 棘刺提取物的除螨活性

取6个培养皿，其中3个培养皿中分别加入1 mL的皂荚棘刺提取物，另3个培养皿，加入1 mL纯水作为阴性对照，每个培养皿内壁上缘均匀涂抹白油凡士林混合物；每个培养皿中心放入200只尘螨，30 min后在培养皿中放入螨虫饲料0.05 g，之后将培养皿置于隔水式培养箱内，开始计时；48 h后，用体式显微镜观察并对死亡螨虫计数。分别按照式（1）和（2）计算自然死亡率和灭螨率［3-4］。

1.2.4 棘刺提取物的抗氧化能力测定

DPPH自由基清除能力测定［5-6］：称取DPPH粉末4 mg，用无水乙醇定容到100 mL，得到0.1 mM DPPH自由基工作液。配制浓度10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL的棘刺提取物溶液，同浓度的抗坏血酸做对照。吸取100 µL待测溶液，加入100 µL DPPH自由基工作液，混匀，在30 ℃下暗室反应30 min，测定在517 nm下的吸光度。按式（3）计算DPPH自由基清除率。

式中：Ai为待测溶液+DPPH溶液的吸光度；Aj为待测溶液+蒸馏水的吸光度；A0为蒸馏水+DPPH溶液的吸光度。

超氧阴离子清除能力测定［7］：先取0.45 mL pH = 8.2的10 mM的Tris-HCl溶液置于25 ℃水浴中温育20 min。再分别加入0.1 mL的待测液和0.04 mL 3mM 邻苯三酚溶液，混匀后25 ℃水浴中反应5 min，加入0.1 mL 的10 mM HCl溶液终止反应，摇匀后放置3 min，在波长325 nm下测定吸光值。以上各浓度样品均做三组平行实验。按照式（4）计算超氧阴离子清除率。

式中：Ai为待测溶液在反应体系中的吸光度；Aj为反应体系中含有待测溶液，以0.04 mL蒸馏水代替邻苯三酚溶液加入体系中的吸光度；A0为蒸馏水代替待测溶液在反应体系中的吸光度。

还原能力测定［8-9］：在1 mL待测溶液中加入0.2 mL pH = 6.6的磷酸盐缓冲液，再加入1 mL 1%铁氰化钾溶液，混匀，50 ℃静置20 min，加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，3000 r/min 离心10 min，取2 mL上清液加入0.35 mL 0.1 %三氯化铁溶液和1 mL蒸馏水。于700 nm 处测定样品的吸光度值。吸光度值越高，表明其还原能力越强。

1.3 数据处理

所有数据均为平均值±平均标准误差（S.E.M）。数据分析使用SPSS 12.0软件完成。

2 结果与分析

2.1 棘刺提取物总黄酮含量测定

2.1.1 标准曲线

计算得知，芦丁的峰面积与其质量浓度呈线性关系，并且经过数据的归纳和分析，得到回归方程为y= 27.011x- 10.74，r = 0.9936（y为峰面积，x为质量浓度，r为相关因数）。由该结果可知，当芦丁的进样浓度控制在0.01 ～ 0.1 mg/mL的范围时，其呈现的线性关系良好。

2.1.2 检测结果

如表1，三次检测结果中棘刺提取物的峰面积分别为992.93、1018.40、1031.77，带入2.1.1所得的标准曲线中可得芦丁含量分别为37.16、38.10和38.60 µg/mL，结合1.2.1中提取实际所用棘刺质量以及提取料液比，可知棘刺提取物中总黄酮的提取率为0.136%，RSD值为2.24%。

2.2 棘刺提取物除螨活性

如表2，在相同环境条件下分别培养试验组螨虫和对照组螨虫，计时48 h。由对照组可知，培养48 h后，空白对照组存活螨虫数分别为181只、178只和185只，平均存活螨虫数为181.0只，即正常调节下48 h螨虫的自然死亡率平均值为13.8%。试验组给药培养48 h后分别存活数为25只、26只和32只，平均存活螨虫数为27.7只，可发现皂荚棘刺提取物给药48 h后的平均灭螨率为91%，与未给药组相比表现出极显著性差异（P＜ 0.01）。由上可知，棘刺提取物可显著提高对螨虫的杀灭率，具有作为一种灭螨剂开发的巨大潜力。

表2 棘刺提取物除螨实验检测结果Tab.2 Results of mite removal experiment of of the extract of Gleditsia Sinensis thron

2.3 皂荚棘刺的抗氧化活性

2.3.1 棘刺提取物对DPPH自由基清除率的影响

由图1可知，Vc作为对照，它的清除能力最强。Vc浓度为1% ～ 10%时，清除率基本维持在90%以上。棘刺提取物的清除能力随浓度的升高而升高，在浓度为0.625% ～ 10%时，棘刺提取物随着浓度的增加不断增大，对DPPH自由基的清除能力从18.40%增长至91.60%，具有明显的浓度梯度效应。当棘刺提取物浓度为10%时，清除能力为91.60%，与Vc的清除能力相当。

图1 棘刺提取物对DPPH自由基清除率的影响Fig.1 Effect of the extract of Gleditsia Sinensis thron on DPPH free radical scavenging rate

2.3.2 棘刺提取物对超氧阴离子自由基清除率的影响

由图2可知，Vc的超氧阴离子自由基的清除能力最强，清除能力高达95%以上。棘刺提取物的超氧阴离子自由基清除率随浓度的升高而增强，具有浓度梯度效应。浓度范围在0.625% ～ 10%时，棘刺提取物的超氧阴离子清除率从29.19%增至90.32%；当浓度到达2.5%值时，随着浓度的不断增加，棘刺提取物的清除率增加趋向逐渐放缓。

图2 棘刺提取物对超氧阴离子自由基清除率的影响Fig.2 Effect of the extract of Gleditsia Sinensis thron on the scavenging rate of superoxide anion radical

2.3.3 棘刺提取物对还原力的影响

由图3可知，在一定质量浓度范围内，棘刺提取物和Vc溶液浓度越大，还原力越强，还原力与浓度呈明显的正相关，随浓度的升高迅速增强。Vc的还原能力最强，还原力基本维持在2.3以上。在浓度范围为0 ～ 10%时，棘刺提取物的还原能力从1.20增至3.63。

图3 棘刺提取物对还原力的影响Fig.3 Effect of the extract of Gleditsia Sinensis thron on reducing power

3 讨论与结论

皂荚棘刺作为我国一种传统的中药材，具有价格低廉，来源广泛，功效突出以及少有毒副作用的特征，在中医抗癌治疗中是最常用的一种配伍药，是少有的具有良好功效的抗癌中药材。目前随着各类分析检测仪器的逐渐普及与发展，对皂荚棘刺中的化学成分的探究也日渐增多，已明确其主要含有黄酮、酚类、氨基酸和三萜类等化合物［18-20］。近年间对皂荚棘刺的研究主要集中在抗炎与抗癌方向［21-23］，在临床应用中多以传统中药形式加以应用，例如以皂荚棘刺辩证配伍少许药材治疗坐骨神经痛，或皂针颗粒治疗慢性阑尾炎，或泽桂癃爽胶囊治疗前列腺增生等［24-26］。在天然日化领域尚无应用背景，对除螨及抗氧化也未有应用实例。

本研究以皂荚棘刺为研究对象，选用75%的乙醇进行提取，以芦丁作为提取物提取率的评价标准，所得的皂荚棘刺提取物中芦丁的含量为0.136%。本文首次对所得的皂荚棘刺提取物的除螨活性进行了探究，利用粉尘螨这类生活中最常见的螨虫进行给药，确定了皂荚棘刺提取物具有良好的除螨活性，在未来螨虫灭杀领域具有一定的开发利用潜力。此外，本研究对所得的皂荚棘刺提取物的抗氧化活性进行了探究，确定皂荚棘刺提取物具有良好的抗氧化效果，目前已有研究结果测定了皂荚棘刺提取物对Fe3+的清除能力［27］，本文加以对DPPH自由基以及超氧阴离子自由基清除实验，相互印证确定了皂荚棘刺具有良好的抗氧化功效，在较高浓度时具有接近Vc的抗氧化效果，补充与完善了皂荚棘刺在除螨以及抗氧化功效方向的空白，为后续的研究提供理论基础，为合理有效利用皂荚棘刺资源提供思路。