HPLC-ELSD法测定东北产平贝母中生物碱含量

张帅，刘文丛，任珅，王梓，李伟，3*

（1.吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春 130118；2.梧州学院 食品与制药工程学院，广西 梧州 543002；3.吉林农业大学 生命科学学院，吉林 长春 130118）

平贝母又名平贝，为百合科植物平贝母（Fritillaria ussuriensisMaxim.）的干燥鳞茎［1］，其性味苦、甘、微寒，归肺、心经，具有清热润肺、化痰止咳的作用。临床上常用于治疗肺热燥咳，干咳少痰，阴虚劳嗽，咳痰带血［2-4］。平贝母的主要化学成分为异甾体类生物碱、多糖、腺苷以及挥发油等［5］。现代药理学研究表明，其在降压、抗癌、抗溃疡、抗炎、抗氧化等方面［6-8］具有非常好的疗效。

平贝母与川贝母、浙贝母具有相同或相似的临床功效［9］，因其市场价格较其他贝母便宜，因此临床上常作为其他贝母的替代品。近年来，平贝母野生种群及数量明显减少，市场上主要为栽培品。东北三省作为平贝母的道地产区［10］，平贝母的产量占全国总产量的90%以上。2020版《中国药典》对浙贝母的含量测定为贝母素甲和贝母素乙的总量不得少于0.080%。目前，关于平贝母中总生物碱［11］、贝母素甲及贝母素乙含量检测［12］等质量方面的研究报道较少。2020版《中国药典》只对平贝母总生物碱含量进行要求，不能精准地体现其质量优劣。因此，本研究采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器（High performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector，HPLC-ELSD）法检测东北三省平贝母药材中贝母素甲及贝母素乙的含量，并基于2020版《中国药典》对不同生长环境下平贝母中水分、总灰分及醇浸出物进行质量评测，为东北道地药材平贝母的深度开发利用及质量评价体系的完善提供理论依据。

1 材料

1.1 试验仪器

Waters e2695高效液相仪（美国Waters公司）；Waters 2424蒸发光散射检测器（美国Waters公司）；SXL-1304马弗炉（杭州卓驰仪器有限公司）；DSH-50-5电子水分测定仪［上海越平科学仪器（苏州）制造有限公司］；SPECTRO star Nano全波长扫描式酶标仪（德国BMG LABTECH公司）。

1.2 试剂与药品

贝母素甲标准品、贝母素乙标准品（ ≥ 99.99 %，成都普思生物科技有限公司）；邻苯二甲酸氢钾，分析纯（北京索莱宝科技有限公司，批号：877247）；溴百里香酚蓝，分析纯（北京索莱宝科技有限公司，批号：76595）；二乙胺、三氯甲烷、乙醇、甲醇均为分析纯；蒸馏水为实验室自制。

1.3 实验材料

平贝母样品共22份，其中产自黑龙江省2份，辽宁省3份，吉林省17份。经吉林农业大学中药材学院李伟教授鉴定，样品均为百合科植物平贝母（Fritillaria ussuriensisMaxim.）的干燥鳞茎，详细产地见表1。

2 实验方法

2.1 平贝母中水分的测定方法

参照2020版《中国药典》通则0832第二法，用电子水分测定仪对平贝母的水分含量进行检测［1］。

2.2 平贝母中总灰分的测定方法

参照2020版《中国药典》通则2302，对平贝母的总灰分含量进行检测［1］。

2.3 平贝母中醇浸出物的测定方法

参照2020版《中国药典》通则2201，用50 %乙醇作溶剂，采用热浸法对平贝母的醇浸出物含量进行检测［1］。

2.4 平贝母中总生物碱含量的测定方法

2.4.1 标准品溶液的制备

参照2020版《中国药典》，精确称定5.0 mg贝母素乙，用三氯甲烷溶解，定容至10 mL容量瓶。

2.4.2 待测样溶液的制备

精确称取平贝母粉末（过0.25 mm孔径筛）2.00 g，置于平底烧瓶内，经3 mL浓氨水浸润1 h后，加入40 mL三氯甲烷-甲醇（4 ∶ 1）的混合溶液并称定重量。将平底烧瓶置于80 ℃水浴中加热回流2 h，过滤，并清洗滤渣，合并滤液，定容至25 mL容量瓶。

2.4.3 标准曲线

分别精密量取对照品溶液1、2、3、4、5、6 mL至25 mL锥形瓶中，用三氯甲烷补足至10 mL，各精密加入0.2 mol/L邻苯二甲酸氢钾缓冲液5 mL和0.03%溴百里香酚蓝缓冲液2 mL，用酶标仪于412 nm波长处检测吸光度值。以吸光度值为纵坐标，对照品的浓度为横坐标，得线性回归方程Y=2.1365X- 0.0034，R2= 0.9922。

2.4.4 样品测定

按照2.4.3中的检测方法，测定样品的紫外吸光度值，并根据线性回归方程计算出样品中总生物碱的含量。

2.5 平贝母中贝母素甲与贝母素乙含量的测定方法

2.5.1 高效液相色谱条件

Tnature C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 µm）；流动相：乙腈-水-二乙胺 = 70 ∶ 29.97 ∶ 0.03；流速1.0 mL/min；进样量20 µL；ELSD参数：漂移管温度为60 ℃，气压40 psi，喷雾器模式为加热，动力级别60%。以贝母素甲峰计，理论塔板数应不低于2000，贝母素甲和贝母素乙与其他物质的分离度应大于1.5。

2.5.2 标准品溶液的制备

用三氯甲烷配制0.2 mg/mL的贝母素甲和0.15 mg/mL的贝母素乙混合标准品溶液。

2.5.3 待测样溶液制备

精确称取平贝母粉末（过0.25 mm孔径筛）2.00 g，置于平底烧瓶内，经3 mL浓氨水浸润1 h后，加入40 mL三氯甲烷-甲醇（4 ∶ 1）的混合溶液并称定重量。将平底烧瓶置于80 ℃水浴中加热回流2 h，待冷却后称定重量，补足减失的重量，经过滤后收集滤液。取滤液10 mL，置于蒸发皿中蒸干并用甲醇溶解，定容至2 mL容量瓶中，加甲醇补足至刻度，摇匀，即得。

2.5.4 精密度试验

取2.5.2中贝母素甲和贝母素乙混标的任一浓度，按照2.5.1中色谱条件吸取20 µL，进行高效液相色谱（High performance liquid chromatography，HPLC）分析，重复进样6次，分别记录它们的峰面积变化情况，并计算相对标准偏差（RSD）值。

2.5.5 重现性试验

精确吸取2.5.2中任一浓度贝母素甲和贝母素乙的混标溶液6份，根据2.5.1中色谱条件，进行HPLC分析，记录混标中贝母素甲和贝母素乙的峰面积，并计算RSD值。

2.5.6 稳定性试验

按照2.5.1中方法，在混标相同浓度情况下，分别在0、2、4、6、8、10、12、24、48 h进样，记录混标中贝母素甲和贝母素乙的峰面积，并计算RSD值。

2.5.7 加样回收率实验

精确吸取2.5.3中的任一平贝母样品溶液，共6份，均分别加入一定量的上述贝母素甲和贝母素乙的混标，按照2.5.1中色谱条件，利用HPLC分析，根据标准曲线计算加样回收率及RSD值。

2.5.8 线性关系考察

按2.5.1中方法将贝母素甲和贝母素乙的混标溶液注入高效液相色谱仪，进样量分别为5、10、15、20、25 µL，并记录各峰面积。以标准品峰面积为纵坐标，标准品质量为横坐标，得线性回归方程。

3 实验结果

3.1 平贝母中水分检测

测定了22份不同产地平贝母样品的水分含量，结果见表2。根据2020版《中国药典》规定，平贝母中水分不得超过15.0%，实验中所有样品的水分含量均在药典要求范围内，均符合药典标准。

表2 不同产地平贝母样品中水分、总灰分及醇浸出物的含量Tab.2 The content of the moisture， total ash and alcohol extract in F. ussuriensis samples from different origins

3.2 平贝母中总灰分检测

测定了22份不同产地平贝母样品的总灰分含量，结果见表2。根据2020版《中国药典》规定，平贝母中总灰分不得超过4.0%，实验中所有样品的水分含量均在药典要求范围内，均符合药典标准。

3.3 平贝母中醇浸出物含量检测

测定了22份不同产地平贝母样品的醇浸出物含量，结果见表2。根据2020版《中国药典》规定，醇浸出物不得少于8.0%，实验中所有样品的醇浸出物含量均在药典要求范围内，均符合药典标准。不同地区平贝母的醇浸出物含量存在一定的差异，含量在9.5% ～ 28.0%之间，部分产地平贝母的醇浸出物含量高于药典要求2倍以上。大部分吉林省产平贝母醇浸出物含量高于辽宁省和黑龙江省产平贝母醇浸出物含量。

3.4 平贝母中总生物碱含量检测

共测定22份不同产地的平贝母样品中总生物碱含量，结果见图1。根据2020版《中国药典》规定，总生物碱含量以贝母素乙（C27H43NO3）计，不得少于0.050%。检测的所有样品均符合药典标准，其中2号样品、6号样品、11号样品、16号样品总生物碱含量高于0.100%，以6号样品总生物碱含量最高，达到0.159%。与HPLC-ELSD检测的贝母素甲和贝母素乙含量结果大致类似，3号、6号、10号、22号产地平贝母的总生物碱含量较高，4号、21号产地平贝母的总生物碱含量较低。但是也存在贝母素甲和贝母素乙含量与总生物碱含量趋势不一致的情况，如13号和16号产地平贝母。

图1 不同产地22份平贝母样品中总生物碱的含量Fig.1 The content of total alkaloids in 22 samples of F. ussuriensis from different origins

3.5 贝母素甲与贝母素乙含量检测

贝母素甲的标准曲线为Y= 239124X- 722579，R2= 0.991，贝母素乙的标准曲线为Y= 167161X-524813，R2= 0.990。其重复性、精密度和稳定性实验中RSD值分别为0.48%、0.32%和0.41%，贝母素甲和贝母素乙的对照品加样回收率分别为98.3%和99.1%，其RSD值分别为1.60%和1.30%。说明该方法可用于平贝母中贝母素甲和贝母素乙的含量检测，其稳定性良好。

平贝母中贝母素甲与贝母素乙含量检测结果如图2和表3所示。22份平贝母样品中，大部分产地样品中贝母素甲的含量高于贝母素乙，且两者的含量均较低。各样品之间的含量差异较大，3号样品、6号样品、13号样品的贝母素甲和贝母素乙总量较高，均在0.005%以上，其中6号样品的贝母素甲和贝母素乙总量最高，达到0.011%。1号样品、2号样品、14号样品的贝母素甲和贝母素乙总量较低，其中1号样品贝母素甲和贝母素乙总量最低，只有0.0018%。

图2 HPLC检测平贝母样品中贝母素甲与贝母素乙Fig.2 Determination of peimine and peiminine in a sample of Fritillaria Ussuriensis Maxim. by HPLC

表3 不同产地平贝母中贝母素甲和贝母素乙的含量Tab.3 The content of peimine and peiminine in F. ussuriensis from different origins

3.6 聚类分析

为了进一步分析22份平贝母样品之间的成分差异，采用SPSS 22.0软件进行聚类分析。结果如图3所示。

图3 不同产地平贝母样品的聚类分析Fig.3 Cluster analysis of F. ussuriensis samples from different origins

以贝母素甲、贝母素乙和总生物碱含量为变量。当分类距离为10时，2批平贝母样品大致分为3类，当分类距离为5时，2批平贝母样品大致分为4类。说明东北三省样品具有一定的相似性，各地之间存在一定的差异。

4 讨论

贝母素甲和贝母素乙作为平贝母的次生代谢产物，可以很好地反映平贝母的质量［13］。药材的含水量过多，会影响药材的品质，导致虫蛀、霉变、潮解、走味等问题［14］。总灰分代表药材中的无机盐及泥沙含量。醇浸出物能够反映药材的内在物质含量。总生物碱为平贝母发挥药理作用的主要物质基础［15］。

本文建立了HPLC-ELSD检测贝母素甲和贝母素乙的方法，并对东北三省不同产地平贝母中贝母素甲和贝母素乙进行含量检测。在基于《中国药典》规定的要求范围内，对平贝母样品进行聚类分析比较，可以更明确东北三省平贝母的质量及其差异［16］。

根据含量检测结果表明，东北三省平贝母以吉林省产平贝母质量最佳。通过聚类分析，表明东北三省各产地之间的平贝母存在一定的质量差异，但是地域的差异对质量影响不太大，质量之间的差异可能为生长环境和生长年限因素的影响。

此次采集的样品中以吉林省平贝母居多，其他两省采集数量较少。同一年生不同品种的平贝母大小存在差异，在5～25 cm之间不等，在很大程度上影响平贝母的质量。不同年生的药材，其主要成分的积累可能存在不同的差异［17-18］。下一步会加大样品采样量，采集同一品种、同一年生的平贝母，继续对东北三省的平贝母进行质量检测。

不同的采收时间及加工方式会对药材的品质造成影响［19-20］。选择最佳的平贝母采收时间，优化平贝母的干燥方式，加强平贝母的产地初加工对平贝母质量的提升有重要意义。