芦丁电化学检测及其水解过程监测研究*

王玉华，朱瑞娟，王晓环，王俊青，孙新堂，2，王成森，2

（1.山东畜牧兽医职业学院，山东 潍坊 261061；2.潍坊市兽用生物发酵技术重点实验室，山东 潍坊 261061）

0 引 言

芦丁水解可制备槲皮素，槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌等生物活性［1］，应用前景较广。目前，检测芦丁或槲皮素的技术手段有高效液相色谱法［2］、液-质联用法［3］、荧光法［4］、电化学分析法［5，6］等。相比之下，电化学分析方法用到的检测设备成本低，仪器操作简单，响应快，检测过程较少用到有毒有害挥发性试剂［7］。

石墨烯（graphene，GR）具有优良的导电性［8］，是常见的电极修饰材料，但分散于水溶液时易发生不可逆团聚［9］，导致导电性能下降。氧化石墨烯（graphene oxide，GO）层间的含氧基团产生静电斥力使其在水溶液中较稳定的存在，GO修饰于电极表面后，再通过电还原制备GR［10］可避免GR的团聚，从而较好地保留GR 的优异性能。另外，基于GR的纳米复合材料展现出了更好的电催化活性、灵敏性和选择性［11，12］。

本文首先将GO修饰碳糊离子液体电极（CILE），干燥后浸于氯金酸（HAuCl4）溶液中，于阴极电位下进行恒电位沉积，金（Au）被沉积在电极表面，同时GO也被原位还原，从而构建了基于Au增敏GR复合材料的Au-rGR／CILE 电化学传感器，Au-rGR／CILE 在芦丁的检测中展现了较高的催化性和选择性，获得了检测芦丁的工作曲线。AurGR／CILE能实现对芦丁和槲皮素的同时检测，进一步应用于芦丁水解为槲皮素的在线检测，为黄酮类活性成分的定性定量检测提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

石墨粉（≥98.5%，西陇科学股份有限公司）；液体石蜡（分析纯，烟台远东精细化工有限公司）；正丁基吡啶六氟磷酸盐（BPPF6，＞99%，中科院兰州物化所）；HAuCl4（麦克林）；芦丁（分析对照品，麦克林）；GO，根据文献［13］合成）；不同pH值的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）作为支持电解质；蒸馏水。

电化学工作站（上海辰华CHI660E型）；工作电极（AurGR／CILE）；参比电极（饱和甘汞电极）；对电极（铂（Pt）电极）；扫描电子显微镜（日本电子公司JSM-6700F型）；酸度计（上海雷磁pHS-3E型）。

1.2 电极制备与修饰

根据文献［14］制备CILE 作为基底电极。将GO 分散于蒸馏水中，超声15 min得到0.8 mg／mL的GO分散液。取10 μL 上述分散液滴涂于CILE 表面，晾干后浸入含2.0 mmol／L HAuCl4的PBS 中，磁力搅拌下于-1.50 V 电位下恒电位沉积300 s，蒸馏水冲洗后N2吹干，一步构建得到Au-rGR／CILE。rGR／CILE在空白PBS 中按相同步骤制得。

2 结果与讨论

2.1 电极表征

以铁氰化钾（K3［Fe（CN）6］）为分子探针对3 种电极进行循环伏安表征，结果如图1 所示。CILE 上氧化还原峰电流（Ip）信号较小；在rGR／CILE上的电流信号增加了约为裸电极的3倍，说明电还原得到的GO具有优良的导电性，能加快分子探针在电极表面的电子转移速率。Au-rGR／CILE上的Ip信号较CILE和rGR／CILE均有增加同时峰电位差减小，表明Au 纳米粒子产生了增敏效应，与GR 共同提高了电极的导电性和催化性。

图1 CILE，rGR／CILE和Au-rGR／CILE的循环伏安曲线（扫速100 mV／s）

图2 为扫描电子显微镜对CILE、rGR／CILE、Au-rGR／CILE表面形貌的扫描电镜图。由图中可看出，图2（a）的界面较为紧密均一，说明石墨粉被液体石蜡和离子液体均匀粘合。图2（b）的界面呈现出折叠和褶皱，明显与图2（a）的不同，说明GO可在恒电位条件下被还原。在图2（c）的界面上，可看到Au纳米颗粒和GR 相互穿插，能够增加电极的比表面积。

图2 CILE，rGR／CILE，Au-rGR／CILE的扫描电镜图

2.2 单因素下芦丁的电化学行为研究

图3 （a）为50 μmol／L芦丁在不同pH值（1.5～5.5）下PBS中的电化学行为。由图可知，缓冲溶液pH 值增大，芦丁的氧化还原峰电位同时发生负移，pH值2.0 时芦丁的电信号最大。pH值1.5～5.5 范围内，势电位（E0′）与pH 值呈线性关系，线性回归方程为E0′（V）＝-0. 059 9pH +0.671（γ2＝0.987），方程斜率接近理论值-0.057 6 V／pH，表明芦丁在Au-rGR／CILE上的电化学反应过程是等电子等质子的。

图3 50 μmol／L芦丁在Au-rGR／CILE上不同pH值、扫速下的循环伏安曲线

图3（b）为50 μmol／L的芦丁在不同扫速（0.03～0.3 V／s）下的循环伏安行为，由图可知，扫速（v）增大，氧化峰电流（Ipa）和还原峰电流（Ipc）增大，并伴随着氧化峰正移（Epa）和还原峰负移（Epc）。线性回归方程为Ipa＝-241.7v1／2+27.97（γ2＝0.976），Ipc＝215.5v1／2-28.67（γ2＝0.993）。峰电压（E）与扫速的自然对数（lnv）的线性回归方程为Epa＝0.010 9lnv+0.617（γ2＝0.978），Epc＝-0.009 17lnv+0.513（γ2＝0.976）。根据公式

式中α为电子传递系数，n为电子转移数，ks为表观异相电子转移速率常数。结合线性方程计算各电化学参数，得到α为0.54，ks为2.77 s-1，n为2。

以上说明芦丁在Au-rGR／CILE表面上的电极反应是两电子两质子的扩散控制过程。

2.3 工作曲线

图4（a）为pH值2.0，扫速0.1 V／s条件下，芦丁在AurGR／CILE上的微分脉冲伏安（differential pulse voltammetry，DPV）曲线。图4（b）为在0.06～50.0 μmol／L 内，工作曲线为Ipa＝0.505c+1.17（γ2＝0.988）；在50.0～400 μmol／L内，工作曲线为Ipa＝0.272c+16.0（γ＝0.999），检测限为0.017 μmol／L（3σ），低于报道值 0. 03 μmol／L［15］，0.028 μmol／L［16］，0.07 μmol／L［17］，表明Au-rGR／CILE 对芦丁的检测具有较高的灵敏度。

2.4 芦丁水解过程的在线检测

芦丁在酸性介质中可以水解得到槲皮素，芦丁酸性条件下的水解反应式如下

图5 为芦丁和槲皮素在pH值2.0 PBS中的DPV曲线，两者的氧化峰电位差约为100 mV，说明Au-rGR／CILE对芦丁和槲皮素能实现同时检测，可为芦丁的水解产物提供定性分析依据。

图5 芦丁和槲皮素标准品的DPV曲线

准确称取芦丁0. 3 g，溶于到100 mL 80 %甲醇+0.5 moL／L HCl溶液中，80 ℃下水浴回流加热，每隔一定时间，移取水解混合液冷却终止水解反应，取400 μL 水解混合液，定容于10 mL pH值2.0 PBS中进行检测。图6（a）为不同水解时间下水解液的DPV曲线，由图可见，随着水解时间的增加，芦丁的响应信号逐渐减小，伴随槲皮素的响应信号逐渐增加，说明芦丁不断水解产生了槲皮素。以ln（c／c0）对水解时间进行线性拟合，线性方程为ln（c／c0）＝0.124 -0.962t（γ＝0.989），水解反应速率常数为0.962 h-1，说明芦丁的水解符合一级动力学反应模型，为芦丁水解过程中浓度的变化进行定量分析提供依据。

图6 水解过程在线检测结果

2.5 选择性、重现性及稳定性考察

按1.2的步骤制备5支Au-rGR／CILE进行循环伏安扫描，电流信号的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）小于4.7%；室温保存2周后，测得的电流信号为不低于原先的95.5%，表明自制电极的重现性和稳定性较好。

3 结 论

采用恒电位法制备了Au-rGR 复合膜修饰CILE，利用该修饰电极获得了检测芦丁的工作曲线，检测浓度范围为0.06～400. 0 μmol／L，检测限为0. 017 μmol／L（3σ），表明Au-rGR／CILE对芦丁的检测具有较高的灵敏度。在温度80 ℃下，80%甲醇+0.5 mol／L HCl 溶液中，芦丁的水解符合一级反应动力学模型，水解常数为0.962 h-1，为芦丁水解过程中黄铜类物质的定性定量检测提供参考价值。