Pi9基因标记辅助选择改良水稻不育系金23A稻瘟病抗性

2023-11-18车凡昊黄俊邹玉莹邓吉奇周庚姚威黄浩黄希来易晓璇谌强李家鑫刘金灵刘雄伦

湖南农业大学学报（自然科学版） 2023年5期

车凡昊，黄俊，邹玉莹，邓吉奇，周庚，姚威，黄浩，黄希来，易晓璇，谌强，李家鑫，刘金灵,2,3，刘雄伦,2,3*

基因标记辅助选择改良水稻不育系金23A稻瘟病抗性

车凡昊1，黄俊1，邹玉莹1，邓吉奇1，周庚1，姚威1，黄浩1，黄希来1，易晓璇1，谌强1，李家鑫1，刘金灵1,2,3，刘雄伦1,2,3*

(1.湖南农业大学农学院，湖南长沙 410128；2.作物基因工程湖南省重点实验室，湖南长沙 410128；3.水稻油菜抗病育种湖南省重点实验室，湖南长沙 410128)

以携带广谱持久的抗稻瘟病基因的籼稻品系75–1–127为供体亲本，以保持系金23B及其不育系金23A为受体亲本，采用基因共显性标记CoInDF1R2进行MAS回交育种，以改良三系不育系金23A及其保持系金23B的稻瘟病抗性；用25份稻瘟菌代表性菌株进行室内苗瘟接种，观察苗瘟抗性表现。结果显示：金23A和金23B的抗性频率仅为28%，而75–1–127的抗性频率为92%；田间病圃抗性鉴定结果显示，75–1–127高抗苗瘟，而金23A和金23B受体亲本均高感苗瘟；共显性标记CoInDF1R2在75–1–127 基因组上扩增出大小为354 bp的PCR产物，对金 23A或金23B基因组的扩增产物大小约470 bp，说明该标记在2个亲本间的多态性明显且稳定；利用CoInDF1R2开展连续多年MAS回交育种实践，培育出了农艺性状优良、丰产性较好的抗病不育系金23A––1及抗病保持系金23B––1，为三系法杂种优势利用提供了新的抗稻瘟病亲本材料。

水稻；稻瘟病；抗性改良；分子标记辅助选择；基因

稻瘟病是由稻瘟菌引起的全球性水稻真菌病害。近年来，中国稻瘟菌年发生面积约5×106hm2，年损失稻谷约1.0×109kg[1]。当前，化学防治与培育抗稻瘟病水稻品种仍是最普遍的防治措施，但是化学防治稻瘟病不仅耗费大量时间与精力，同时破坏自然生态环境：因此，防治稻瘟病应以培育高抗水稻品种为核心，辅以化学防治和田间管理。利用已克隆或定位的抗瘟基因培育广谱、持久的高抗水稻新品种(组合)是降低稻瘟病危害的经济、有效、绿色手段[2]。小粒野生稻()是基因的来源，基因对来自20个国家(地区)的稻瘟菌菌株表现出抗性，且已被成功克隆[3–4]。分子标记辅助选择育种(简称MAS育种)相较于传统育种具有不受环境影响、不受等位基因显(隐)性干扰的优点，选择效率高，育种进程快，越来越受育种家们青睐。近年来多名研究人员[5–9]根据基因序列信息开发了多个功能分子标记，用于杂交稻亲本稻瘟病抗性改良，效果显著。三系不育系金23A及其保持系金23B是由湖南省常德市农业科学研究所选育而来，具有株型紧凑、败育彻底、配合力强、米质优良等特点[10]，但易感稻瘟病。本研究以籼稻品系75–1–127作为基因的供体亲本，先后用保持系金23B及其不育系金23A作受体亲本，利用基因功能标记，开展MAS连续回交育种实践，旨在改良其稻瘟病抗性，为三系法杂种优势利用提供新的抗稻瘟病亲本材料。

1　材料与方法

1.1　供试材料

抗病基因供体为籼型水稻品系75–1–127，源自国际水稻研究所，由小粒野生稻与籼稻IR3197远缘杂交后连续回交选育而来，含有广谱、持久的抗稻瘟病基因，对来自13个国家的43个稻瘟菌菌株均表现出较强的抗性。

受体亲本为三系不育系金23A及其保持系金23B。

感病对照为籼型水稻品系CO39，对绝大多数稻瘟菌生理小种(菌株)表现高感。

1.2　试验方法

1.2.1分子标记辅助选择育种实践

自2012年起，在湖南长沙和海南三亚两地利用获选的标记CoInDF1R2持续多年进行MAS回交育种，于2018年成功繁育出金23B×75–1–127的BC4F3群体；选择表现优异的抗病保持系纯系金23B–作为供体亲本及轮回亲本，同时以金23A作为受体亲本，继续进行成对杂交/回交，进一步改良金23A的稻瘟病抗性。于2021年获得多个金23A×金23B–的BC3F1抗病不育系群体和金23B–的BC4F7改良抗病保持系群体。对所获改良不育系及其保持系进行综合分析，遴选出综合性状优良的抗病不育系金23A–及其保持系金23B–。

1.2.2抗稻瘟病的鉴定与评价

稻瘟菌的接种及苗瘟表型鉴定。2018—2022年，在人工气候室播种金23B、金23A、75–1–127和CO39，幼苗长至4叶期，分别用25份稻瘟菌菌株的单孢悬浮液喷雾接种。接种孢子浓度约1×105个/mL，温度26～28 ℃，相对湿度>90%，暗培养1 d后，12 h光照/12 h黑暗继续培养5～6 d，调查发病情况。如果感病对照CO39没发病，则重复该菌株的接种试验。参考BONMAN等[11]的0～5级抗性分级标准分类(0～2级为抗病，3～5级为感病)，按照文献[9]的方法计算各水稻材料的抗性频率。

田间病圃苗瘟的表型鉴定。于2020—2022年在湖南省浏阳大围山天然病圃开展田间病圃苗瘟的表型鉴定。鉴定材料为金23B及其改良系金23B–、金23 A及其改良系金23 A–、75–1–127(抗病对照)、CO39(感病对照及诱发品种)。条播催芽后的鉴定材料种子，诱发品种CO39播于厢面四周，2叶1心期移栽于苗床四周，诱导发病；按6级标准调查苗瘟发病情况，评估材料抗病等级：0～1级为高度抗病；2级为抗病；3级为感病；4～5级为高度感病。

1.2.3标记基因型的分析

DNA的提取。取金23A–与金23B–嫩叶各0.2 g，放入2 mL离心管中，采用CTAB法[12]提取DNA。

标记基因型的鉴定。用基因功能标记ColnDF1R2(F，5–ATCCACGAAACATCCACCATC C–3；R，5–TGAGCTAGCTCTTGCCTCCGAG–3)鉴定各单株的基因型。DNA模板经PCR扩增后，采用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行基因型分析。PCR反应体系(10 μL)：模板DNA1.0 μL，2 pmol/μL primer pairs 1.0 μL，ddH2O 3.0 μL，2×PCR Master Mix 5 μL。PCR程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃左右(具体退火温度视引物而定)退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后72 ℃终延伸5 min。

单个悬挂小车液压回路如图3所示.该液压原理主要回路为平衡、调压回路,双联齿轮泵，适应悬挂系统的不同工况,各液压回路、元件的功能与液压蓄能式悬挂一致.由于单个机械液压式悬挂有2个液压悬挂油缸,区别于单个液压蓄能式悬挂的4个悬挂油缸,其承受的负载发生变化,故需对液压油缸结构重新设计.

1.2.4不育系不育特性的调查

参考王明等[13]的方法，2022年调查改良不育系金23A–及受体亲本金23A的不育特性。于改良不育系金23A–及受体亲本金23A孕穗末期，使用羊皮纸袋随机套袋10株，2次重复，20 d后取下羊皮纸袋，调查不育系的自交结实率。于不育系终花后，随机取10株，每株3穗，共30穗，2次重复，调查柱头外露率(包括单边外露和双边外露)。不育系开花盛期，随机取10株，每株取1穗，每穗取不同部位3朵颖花的花药，用镊子捣碎后，再用1% I2–KI染色，观察花粉粒密度、形状及染色情况。每个株系重复镜检3次，调查花粉育性及败育类型。

1.2.5农艺性状与产量性状的调查

2022年记载改良不育系金23A–及其改良保持系金23B–的播始历期，以相应受体亲本金23A和金23B为对照。成熟期各材料每个小区随机取样15株，参照文献[14–15]的方法，调查株高、剑叶长、剑叶宽、单株有效穗数、每穗总颖花数、每穗实粒数以及主穗穗长等。

1.2.6米质分析

随机称取50 g改良保持系金23B–及其受体亲本金23B的种子，经糙米机和精米机打磨后称量15 g精米，4 ℃保存24 h后做成米饭，采用米饭食味计(日本佐竹STA1B)测定米饭口感、外观和综合食味值；采用米饭硬度黏度计(日本佐竹RHS1A)测定米饭的硬度、黏度等指标。

2　结果与分析

2.1　亲本苗瘟抗性评价

25份稻瘟菌菌株室内人工接种苗瘟的表型结果(表1) 显示：对于日本菌株KOH和韩国菌株ROR1，供体亲本75–1–127表现感病，对其余23份菌株均表现抗病，抗性频率为92.0%；受体亲本金23A和金23B仅对7份菌株(195–2–2、CHL473、CHL1743、M2006123A2、CHL645、KJ105、KOH)表现抗病，而对18份菌株表现感病，抗性频率仅为28.0%；金23A与金23B的抗性表型、抗菌谱一致，表明稻瘟病抗性受核基因控制，2个材料具有相同的细胞核背景；25份供试菌株均对感病对照CO39致病；日本菌株KOH与韩国菌株ROR1对75–1–127致病，但KOH对金23A和金23B不致病，说明供体亲本和受体亲本间存在交叉抗菌谱，通过杂交重组可以培育出抗菌谱比75–1–127更广的新型不育系及其保持系。

表1　亲本材料的苗瘟抗性表现及抗菌谱

R、S分别表示抗病和感病。

2.2　MAS改良抗病不育系及其保持系

CoInDF1R2多态性明显且稳定，属于InDel共显性标记。该标记在供体亲本75–1–127基因组上的PCR扩增产物大小为354 bp，在受体亲本金23B和金23A基因组的扩增产物大小均为470 bp左右，条带单一稳定，凝胶电泳能轻易区分(图1)。采用CoInDF1R2开展连续多年的MAS育种实践，先后改良金23B和金23A的稻瘟病抗性。2018年夏季获得6个金23B×75–1–127的BC4F3群体，根据稻瘟病抗性及主要农艺性状、产量性状，遴选出1个优系金23B––4。2018年开始用于金23A的MAS回交改良，于2021年夏季获得金23A×金23B––4的BC3F1群体(金23A改良系)和保持系金23B––4的BC4F7群体(金23 B 改良系)。2022年进行田间病圃抗性鉴定，从鉴定结果(图2)可以看出，金23A––4、金23B––4高抗稻瘟病。2022年秋季用湖南稻区稻瘟菌优势菌株110–2室内接种改良不育系及其保持系，进一步验证了改良系金23A––4、金23B––4高抗稻瘟病(图3)。

a　CoInDF1R2标记基因型；b　病圃苗瘟抗性表型；M DNA ladder；1 75–1–127；2　金23B；3　金23A；4 CO39；5～13　金23B–Pi9随机单株；14～21　金23A–Pi9随机单株；R　抗病；S　感病。

图2　改良不育系及其保持系的病圃苗瘟抗性表现

图3　改良不育系及其保持系的离体接种苗瘟抗性表型

2.3　改良抗病不育系金23A–Pi9的不育特性

金23A–与受体亲本金23A的开花习性和不育特性高度相似，两不育系均有明显的包颈现象，盛花期5 d左右，花时较早(夏季晴天约10:00始花，11:00盛花)，张颖角度较大。金23A–的柱头外露率为65.1%，略高于金23A的柱头外露率(62.3%)；花药短小、浅白色，套袋自交结实率为0。镜检花粉粒少，呈典败(图4)。保持系金23B–和金23B均能正常抽穗开花，不包颈，花药呈鲜黄色，充盈饱满，花粉数量充足，花粉粒具有正常的育性，碘染后呈现蓝黑色(图4)。可见改良抗病不育系金23A–异交习性好，不育性彻底。

图4　金23A与金23B及其改良系的花粉育性鉴定结果

2.4　金23A–Pi9与金23B–Pi9的主要农艺性状

从表2可以看出，金23A–和金23B–播始历期分别为65、62 d，比相应受体亲本延长2 d，均属于早熟类型。由于2个不育系都有包颈现象，其株高均比对应保持系矮10 cm左右；金23A–的株高约68 cm，较金23A略有增加，但不影响配组。金23A–及金23B–的株型紧凑，剑叶长虽比受体亲本略有增加，但叶片挺举不披。改良不育系及其保持系的分蘖力增强，有效穗数增多，穗长虽略有变短，但着粒密度增大，穗粒数增加，丰产性更好。

表2　不育系和保持系的主要农艺性状

2.5　改良抗病保持系金23B–Pi9米质分析

金23B–及受体亲本金32B的外观及食味品质分析结果见表3。相较于金23B，金23B–的米饭外观评分略低，米饭弹性指标无差异，但米饭口感、硬度、黏度及综合得分均优；金23B–米饭黏度较金23B的高650%，这可能也是米饭综合评分相较亲本有所提升的主要原因。

表3　保持系米质分析结果

3　结论与讨论

稻瘟病是威胁水稻安全生产的病害之一。为了降低其危害，培育和推广抗性品种是最有效的手段。分子标记辅助选择准确率高且操作简便，在水稻抗病虫育种中被广泛应用，获得了许多优良水稻品种或育种材料[16–23]。

本研究利用筛选出的基因特异共显性InDel标记CoInDF1R2，以金23B和金23A为受体亲本，连续多年开展了MAS回交育种实践，获得的改良抗病不育系金23A–不育性稳定且败育彻底；对应的改良抗病保持系育性正常。改良后的金23A–及其保持系金23B–的株高适中，株型良好，较受体亲本稻瘟病抗性提高，丰产性更好，具有更好的应用前景，可为三系法杂交水稻育种提供新的亲本资源。

从室内接种试验结果来看，金23A及其保持系金23B的抗性差，抗菌谱较窄，而75–1–127的抗性好，抗菌谱广。日本菌株KOH虽对75–1–127致病，但对金23A和金23B不致病，这表明供体亲本和受体亲本间存在交叉抗菌谱，利用基因定向改良金23A及其保持系金23B的稻瘟病抗性具有可行性，可以通过杂交重组培育出抗菌谱比75–1–127更广的新型不育系及其保持系。因2种对75–1–127致病的稻瘟菌菌株(ROR1、KOH)都来自国外稻区，推测本研究培育出的改良抗病不育系、保持系及其杂交种更适合在国内推广应用。此外，本研究发现，改良抗病不育系及其保持系的剑叶长和剑叶长宽比相较受体亲本明显增加，这可能是受供体亲本75–1–127的影响。75–1–127源自小粒野生稻，拥有较长的叶型和较大的叶面积指数。根据作物的“源库流”理论，只有当“源”充足时，才能满足“库”所需的供应，从而提高产量。推测更长的叶型和更大的叶面积指数可提升金23A––1及其保持系金23B––1的丰产特性。

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Improving blast resistance of rice CMS line Jin23A using marker-assisted selection of thegene

CHE Fanhao1，HUANG Jun1，ZOU Yuying1，DENG Jiqi1，ZHOU Geng1，YAO Wei1，HUANG Hao1， HUANG Xilai1，YI Xiaoxuan1，CHEN Qiang1，LI Jiaxin1，LIU Jinling1,2,3，LIU Xionglun1,2,3*

(1.College of Agronomy, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China; 2.Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province, Changsha, Hunan 410128, China; 3.Rice and Rapeseed Disease Resistance Breeding Key Laboratory of Hunan Province, Changsha, Hunan 410128, China)

To improve blast resistance of the rice cytoplasmic male sterile(CMS) line Jin23A and its maintainer Jin23B, the indica rice line 75-1-127 carrying a broad-spectrum and durable blast resistance genewas used as the donor parent, and Jin 23B and Jin 23A were used as the acceptor parents, a co-dominant marker, CoInDF1R2, was developed according tosequence , then was employed in marker-assisted selection breeding practice. Greenhouse inoculation assay was performed using twenty-fiveisolates collected from different rice areas. The results showed that thegene donor rice line 75-1-127 showed much higher resistance frequency(92%) than those of two acceptor parents Jin23A and Jin23B(28%). Accordingly, 75-1-127 showed high-level seedling blast resistance but highly susceptible for the receptors in natural nursery. CoInDF1R2 showed clear and stable co-dominant polymorphism between the donor and acceptor parents, amplifying a 354 bp DNA band from genome of 75-1-127, while the PCR product from either genome of Jin23A or Jin23B was about 470 bp. An improved CMS line Jin23A-and the corresponding maintainer Jin23B-were created through consecutive backcross breeding practice by marker-assisted selection of the CoInDF1R2 marker. Then, Jin23A--1 and Jin23B--1 were screened as the goal CMS line and maintainer. This study had set the stage for developing elite hybrid rice varieties with superior blast resistance using the three-line method of heterosis utilization.

rice; blast; resistance improvement; molecular marker-assisted selection;gene

S511.034

1007–1032(2023)05–0503–06

车凡昊，黄俊，邹玉莹，邓吉奇，周庚，姚威，黄浩，黄希来，易晓璇，谌强，李家鑫，刘金灵，刘雄伦．基因标记辅助选择改良水稻不育系金23A稻瘟病抗性[J]．湖南农业大学学报(自然科学版)，2023，49(5)：503–508．

CHE F H，HUANG J，ZOU Y Y，DENG J Q，ZHOU G，YAO W，HUANG H，HUANG X L，YI X X，CHEN Q，LI J X，LIU J L，LIU X L．Improving blast resistance of rice CMS line Jin23A using marker-assisted selection of thegene[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2023，49(5)：503–508．

http://xb.hunau.edu.cn