一种新型基于罗丹明B选择性检测食品中铬离子的荧光探针的研究*

赖丽清，范晓慧，黄鹭强，李达谅*

（1.福建师范大学生命科学学院，福建 福州 350117；2.建瓯市东游镇人民政府，福建 南平 353000）

铬（Cr）是人体生长发育所必需的微量元素之一，但过高水平的铬（Ⅲ）离子会影响机体内的酶活性，破坏细胞结构，导致氧化还原失衡，影响体内抗氧化系统的平衡，损害皮肤、肝、肠、呼吸系统等，导致皮肤出现红斑、溃疡、水肿等症状，引起鼻黏膜肿胀、头痛、呼吸气短、嗅觉减退、鼻出血等危害[1-3]。有研究表明，若长期大量摄入铬（Ⅲ），人体患高血压、肺癌、食管癌、糖尿病等疾病的可能性增加[4-6]。近十几年来，随着现代经济的快速发展，特别是工业生活三废的过量排放、含金属农药肥料的随意滥用和含金属常见日用品的不当处理，导致了重金属被大量排放到土壤和地表水中，严重污染环境[7,8]。环境中的重金属很容易以离子形式通过生物链在水产品、农作物等食品中积累，通过食物链被人体吸收，在生物体内积累，威胁着人们的身体健康[9,10]。因此，便捷、快速、高效、准确地对重金属铬离子实施监测对提高食品安全和保障人体健康具有重大意义。

目前，已有多种检测技术用于铬的检测，如电感耦合等离子体质谱法[11]、石墨炉原子吸收光谱法[12,13]、伏安法[14,15]、高效液相色谱法[16]等，但这些方法大多存在仪器成本高、操作复杂、检测时间较长等问题，限制其实现快速、实时检测[17,18]。近年来，小分子荧光探针法因操作简单、灵敏度高、检出限低、选择性好、响应时间快、不需参考溶液、便捷的可视化等优点而引起人们的广泛关注[19]。其主要原理是基于探针分子选择性识别目标分子后与其结合，并在一定的波长范围内引起荧光光谱发生变化，而这种变化常常伴随着浓度依赖性。利用这一特性，可达到定性与定量检测目标分子的目的。目前越来越多可特异性识别目标分子的荧光探针被设计开发出来，并广泛应用于食品行业[20,21]。

罗丹明螺内酰胺或螺内酯衍生物是非荧光且无色，而相应螺内酰胺/内酯的开环产生强烈的荧光发射和颜色变化，是制备荧光增强型探针的良好选择，也是目前为止研究最多的一类荧光探针[22,23]，但较少数探针可特异性识别Cr3+。因此，本研究基于罗丹明B结构设计合成了一种新型选择性识别铬（Ⅲ）离子的荧光探针（FS-Cr），并通过结构表征和光谱特性表征对探针的传感性质展开了研究。

1 实验部分

1.1 主要试剂与仪器

罗丹明B，购于安耐吉化学试剂公司；噻吩-2,5-二甲醛，购于毕得化学试剂公司；85%水合联氨、无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氘代氯仿、二甲亚砜、乙腈、六水合三氯化铬、四水合氯化亚铁、氯化钴、氯化铅、氯化锌、氯化铝、氯化钙、硫酸镉、碳酸铯、五水合硫酸铜、氯化汞、氯化钾、氢氧化锂一水化合物、氯化镁、氯化锰、氯化钠、氯化铵、氯化镍、氟化钠、溴化钠、碘化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、69%的硝酸、30%过氧化氢，均购于国药集团化学试剂有限公司；紫菜、海苔，市售实际样品。

核磁共振波谱仪，美国布鲁克公司；LCQ-FLEET质谱仪，美国赛默飞世尔科技公司；UV-1900双光束紫外可见分光光度计，日本岛津公司；FS5荧光分光光谱仪，爱丁堡仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 探针FS-Cr的合成

在25 mL 的圆底烧瓶中依次加入罗丹明B（888.48 mg，2.00 mmol）、水合联氨（640.80 mg，20 mmol）、无水乙醇（200 mL）中，将混合物置于90 ℃下加热回流搅拌过夜。薄层层析（TLC）检测反应进程，展开剂为石油醚∶乙酸乙酯=2∶1（体积比）。反应结束后，减压旋蒸去除溶剂，化合物1粗产物由硅胶柱层析色谱分离纯化，洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯= 2∶1（体积比），得到灰色化合物1，产量为415.88 mg，产率为45.60%。

在25 mL的圆底烧瓶中依次加入化合物1（228 mg,0.50 mmol）、噻吩-2,5-二甲醛（70 mg,0.50 mmol）、无水乙醇（10 mL），将混合物置于90 ℃下加热回流搅拌过夜。薄层层析（TLC）检测反应进程，展开剂为石油醚∶乙酸乙酯=2∶1（体积比）。反应结束后，减压旋蒸去除溶剂，探针粗产物由硅胶柱层析色谱分离纯化，洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯=7∶1（体积比），得到黄色化合物即为探针，产量为333 mg，产率为57.5%。合成路线见图1。

图1 探针的合成路线

1H NMR(400 MHz,Chloroform-d)δ9.81(s,1H),9.24(s,1H),7.97(s,1H),7.53(d,J=33.8 Hz,3H),7.20-7.07(m,2H),6.70-6.09(m,6H),3.33(s,8H),1.15(s,12H)；13C NMR(101 MHz, Chloroform-d)δ 183.26,165.03,149.03,143.79,141.42,136.19,133.76,129.01,128.65,128.02, 124.36,123.50,107.84,106.04,98.06,44.42,12.71.MS(EI)，m/z:C34H34N4O3S 计算值578.24，实测值578。

1.2.2 溶液的制备

⑴ 探针工作液的制备

精确称取一定量的探针粉末，溶于二甲亚砜溶液中，配置成浓度为10 mmol/L的探针工作液。

⑵ 不同分析物溶液的制备

精确称取一定量的不同分析物六水合三氯化铬、四水合氯化亚铁、氯化钴、氯化铅、氯化锌、氯化铝、氯化钙、硫酸镉、碳酸铯、五水合硫酸铜、氯化汞、氯化钾、氢氧化锂一水合物、氯化镁、氯化锰、氯化钠、氯化铵、氯化镍、氟化钠、溴化钠、碘化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，溶于去离子水中，配制成浓度为100 mmol/L的分析物溶液。⑶ 样品前处理

紫菜样品编号为1，海苔样品编号为2。使用去离子水仔细清洗样品，在干净烧杯中，分别准确称取0.1 g样品，依次加入5 mL 69%的硝酸溶液，2 mL 30%的过氧化氢溶液，超声20 min，直到样品消解完全。将消解液转至50 mL容量瓶中，用去离子水定容，制成样品检测液备用。

1.3 探针传感特性研究

1.3.1 选择性分析

依次向比色皿中加入3 mL乙腈溶液、3 μL探针工作液（10 mmol/L）、6 μL不同分析物溶液（100 mmol/L），充分混匀。用荧光分光光度计扫描，获得荧光光谱，记录荧光强度，荧光分光光度计的激发波长555 nm，狭缝宽度为2 nm。

1.3.2 反应时间分析

依次向比色皿中加入3 mL乙腈溶液、3 μL探针工作液（10 mmol/L，充分混合，间隔2 min，采用1.3.1条件获得荧光光谱，记录荧光强度。

依次向比色皿中加入3 mL乙腈溶液、3 μL探针工作液（10 mmol/L）、6 μL六水合三氯化铬溶液（100 mmol/L），充分混合，间隔2 min，采用1.3.1条件获得荧光光谱，记录荧光强度。

1.3.3 反应浓度响应分析

依次向比色皿中加入3 mL乙腈溶液、3 μL探针工作液（10 mmol/L）、不同浓度的六水合三氯化铬溶液（0～200 μmol/L），充分混匀。采用1.3.1条件获得荧光光谱，记录荧光强度。

1.4 实际样品检测及加标回收

1.4.1 实际样品检测

依次向比色皿中加入3 mL乙腈溶液、3 μL探针工作液（10 mmol/L）、2 μL探样品检测液，充分混匀。采用1.3.1条件获得荧光光谱，记录荧光强度。

1.4.2 加标回收

在1.4.1基础上，再加入不同浓度的六水合三氯化铬溶液（2、4 μmol/L），充分混匀，再次扫描获得荧光光谱，记录荧光强度，平行实验3次。

1.5 数据分析

以Cr3+浓度为横坐标，以紫外吸收值和荧光强度分别为纵坐标分析其线性关系，计算检测限。根据国际理论化学和应用化学联盟（IU-PAC）的规定[18]，检测限公式为 LOD=3b/k，其中信噪比为3，b为25次平行测得的空白溶液的标准偏差，k为荧光强度变化曲线的斜率。采用Chem Draw 2020软件绘制相应的分子结构。采用Origin 2021软件记录、分析、处理实验数据并绘制相关图像。

2 结果与讨论

2.1 探针传感特性研究

2.1.1 选择性分析

通过测定探针对不同分析物（Cr3+，Zn2+，Fe2+，Pb2+，Cd2+，Hg2+，Co2+，Ca2+，Mg2+，Cu2+，Mn2+，Cs2+，K+，Na+，Li+，NH4+，Ni+，Al3+，F－，Br－，I－，HCO3－，CO32－，SO42－，HPO42－，H2PO4－）的荧光响应，探究其传感特性。结果如图2，在含有探针的乙腈溶液中只有在加入Cr3+后体系颜色从无色变为亮粉色，探针开启强荧光，在555 nm激发波长下，荧光强度变化最大，在584 nm发射波长处荧光强度显著增大了81904.30倍，而其他离子的加入，体系的荧光光谱变化非常小。所以，探针对Cr3+表现出非常高的选择性荧光响应。

图2 探针加入不同离子后的荧光光谱

2.1.2 反应时间响应

本研究还考察了响应时间对荧光探针的影响，结果如图3，探针在乙腈溶液中随着时间的递增，在584 nm处的荧光强度没有发生明显变化，这表明探针能在乙腈溶液中稳定存在。而继续加入Cr3+（200 mmol/L）离子后，在0～4 min内体系的荧光强度迅速减弱，之后基本没有发生变化，这表明探针与Cr3+反应时间为6 min。基于此，展开后续实验。

图3 反应时间对探针识别 Cr3+ 的影响

2.1.3 反应浓度响应

灵敏度是荧光探针的另一重要指标，所以通过测定探针对不同浓度的Cr3+的荧光响应，探究其浓度响应特性。结果如图4，随着Cr3+浓度的增加，体系的荧光强度逐渐增大。由图可知，在555 nm激发波长下，584 nm发射波长处的荧光强度呈现出浓度依赖性。在3～15 μmol/L范围内584 nm处的荧光强度与Cr3+浓度呈现出良好的线性关系，回归方程为，线性相关系数R2为0.995，通过计算检测限（LOD）为0.059 μmol/L。探针对Cr3+的浓度响应在荧光光谱响应中表现良好，具有优异的应用前景。

图4 探针在乙腈溶液中随着Cr3+ 浓度增加荧光强度变化

图5 探针在乙腈溶液中检测样品的荧光光谱

2.2 实际样品检测及加标回收

为探究探针实际应用情况，随机购买市售2份水产制品（藻类）进行了测定。探针工作液加入样品1后体系在584 nm发射波长处测得的荧光强度为22929.78。加入样品2后体系在584 nm处测得的荧光强度为38469.70。通过标准曲线计算，样品1中Cr3+浓度为222.15 μg/kg，样品2中Cr3+浓度为359.18 μg/kg。采用加标回收的方法进一步探究荧光探针法准确性，结果如表1所示。方法回收率在101.32%～118.5%。表现良好，满足分析要求。

3 结论

本研究基于罗丹明结构设计合成了一种新型可选择性识别Cr3+的开启型荧光探针。探针在乙腈溶液中只有识别Cr3+时，引起体系溶液由无色变为亮粉色，并开启强烈荧光。通过研究探针的传感特性成功构建了一种高效灵敏可检测食品中Cr3+含量的荧光检测方法。该方法线性范围宽、检测限低、检测速度快，在实际样品检测中也表现良好，有望应用于市场监测。

样品种类Cr3+加标量（μmol/L）样品1样品2 024024实际Cr3+含量（μmol/L）8.41±0.0094 10.63±0.0190 12.45±0.0014 8.44±0.0022 10.81±0.0118 12.53±0.0502加标回收率－111.21%101.32%－118.50%102.25%