分子标记在蚕豆遗传育种中的研究进展

张兴民 池小娜 顾文媛 邵 扬 王玉萍*

（1 甘肃农业大学园艺学院，甘肃兰州 730000；2 甘肃省临夏回族自治州农业科学院，甘肃临夏 731100）

蚕豆（ViciafabaL.，2n= 12），又名胡豆、罗汉豆等，为豆科（Leguminosae）巢菜属（Vicia）一年生或越年生草本植物，主要分布在欧洲、亚洲和北美洲，是世界第六大食用豆类作物（袁璟亚 等，2022）。据FAO 资料统计，2019 年全球蚕豆种植面积257.72 万hm2，总产量543.15 万t；中国种植面积83.96 万hm2，总产量174.09 万t，均居世界第一（王晨瑜，2021）。我国的西北、西南和江浙地区是春蚕豆和秋蚕豆主产区，长江以北地区为春播区，以南为秋播区（周瑶 等，2022）。蚕豆为常异花授粉植物，自然异交率为5%～20%，杂合度高，种群内的分类比较困难且分类体系杂乱（王海飞和宗绪晓，2011）。迄今为止，蚕豆与属内野生种的种间杂交及转基因育种鲜见获得成功的报道，遗传变异主要来自于自然变异或者基因突变（包世英，2016）。我国蚕豆栽培历史悠久，在长期的进化和演化过程中，形成了丰富的种质资源，目前已收集并保存在种质库中的蚕豆资源逾5 200 份，其中，65%为国内种质资源，其余为国外引进资源（包世英，2016）。不同地理来源和用途的种质资源，在生育期、株高、开花习性、分枝数、花色、籽粒大小、粒色、种皮颜色、荚长、荚宽、荚粒数、单株荚数、百粒重、抗病性和品质等形态特征和生物学特性上形成明显差异，表现出丰富的遗传多样性（宗绪晓，2006），可以为蚕豆品种的遗传改良提供重要资源。长期以来，蚕豆种质资源评价主要采用传统的田间鉴定，即以植株表型为基础，这种方法易被育种家接受，但是也易受环境条件及栽培措施的影响，结果缺乏准确性。随着登记品种的逐渐增多，品种间的相似度越来越大，仅通过传统的田间表型鉴定往往难以区分。利用分子标记比较各品种（材料）之间的差异，分析遗传背景，判断亲缘关系并进行分类，为种质资源的遗传多样性分析和科学配制育种组合提供了新方向。Jayakodi 等（2023）成功测序并组装了第1 个高质量的蚕豆参考基因组（约13 Gb），对于新型分子标记开发及蚕豆分子遗传学研究奠定了理论基础。本文分析了分子标记的类型、发展及其在蚕豆遗传育种方面的研究进展，并探讨了其发展前景，以期为蚕豆遗传育种和种质资源开发利用提供参考。

1 分子标记的类型及发展

随着高通量测序技术的进步，DNA 分子标记已经发展到第3 代（陈星和高子厚，2019）。最初是基于DNA-DNA 杂交的低通量分子标记技术，包含限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、数目可变串联重复多态性（variable number tandem repeats，VNTR）、染色体原位杂交（chromosome in situ hybridization，CISH）等。这类分子标记多态性程度低，对DNA质量要求高，难以用于大规模育种实践（王明湖等，2017）。第2 代分子标记技术可分为两种类型：一类是基于PCR 技术的分子标记技术，含随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphism DNA，RAPD）、简单重复序列间扩增（intersimple sequence repeat，ISSR）、 简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）、相关序列扩增多态 性（sequence related amplified polymorphism，SRAP）、 特定序列扩增（sequence characterized amplified regions，SCAR）以及靶位区域扩增多态性（target region amplified polymorphism，TRAP）等。另一类为PCR 与限制性酶切结合的分子标记技术，含扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）和酶切扩增多态序列（cleaved amplified polymorphism sequence-tagged sites，CAPS）等。第2 代分子标记技术的多态性较第1 代高，需要的DNA 量较少（梁帅，2021）。第3 代分子标记技术是以高通量测序和DNA 芯片技术为核心的分子标记技术，包括单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）、DNA条形码技术（DNA barcode）、插入/缺失多态性（insertion-deletion，InDel）、单链构象多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP）、 竞争性等位基因特异性PCR（kompetitive allele specific PCR，KASP）。第3 代分子标记分布密度高、遗传稳定性好且多态性丰富，兼具高通量和自动化检测（Hechanova et al.，2021）。

2 分子标记在蚕豆遗传育种中的应用

2.1 遗传连锁图谱构建

农作物的产量和品质性状大多数是多基因控制的数量性状，遗传连锁图谱在数量性状位点（quantitative trait locus，QTL）的遗传鉴定中起关键作用（刘程宏 等，2021）。在早期，蚕豆遗传连锁图谱的构建主要采用形态标记和同工酶标记方法，后来采用DNA 分子标记法，但是标记在基因组中的分布密度低，定位到的QTL 由于精度有限无法开展精细定位和克隆。因此，整合不同类型的标记构建蚕豆高密度饱和遗传连锁图谱的研究大量开展。自从Vande 等（1991）采用形态标记、同工酶、RFLP 和RAPD 标记构建了首张蚕豆遗传连锁图谱（连锁群7 个，总长度231.40 cM）以来，表达序列标签（expressed sequence tag，EST）、SSR、EST-SSR 和SNP 标记的不断发展丰富了蚕豆遗传连锁图谱的研究。Pozarkova 等（2002）从蚕豆特异性DNA 文库中开发了位于1 号染色体上的SSR标记。Roman 等（2004）将1 号染色体上开发的SSR 标记用于构建遗传连锁图谱。Ma 等（2013）构建了首张完全利用SSR 标记的蚕豆遗传连锁图谱，包含15 个连锁群和128 个SSR 标记。Yang等（2019）对此图谱进行了标记加密，构建了包含7 个连锁群、465 个SSR 标记的新遗传连锁图谱，总长度在原图谱基础上增加了2 928.45 cM，平均遗传距离缩短了2.79 cM。Satovic 等（2013）报道了第1 个蚕豆参考共识遗传连锁图谱，覆盖了4 062 cM 的遗传长度，含6 个主要连锁群。Kaur等（2014）构建了第1 张完全基于SNP 的蚕豆通用连锁图谱，总长度为1 216.8 cM，覆盖12 个连锁群，平均标记间距为2.3 cM。Carrillo-Perdomo等（2020）利用3 个作图群体构建了高饱和度遗传连锁图谱，该图谱包含1 728 个SNP 标记，分布于6 个连锁群。Sudheesh 等（2019）构建的整合图谱是目前蚕豆中饱和度最高的遗传连锁图谱。该图谱包含1 850 个SNP 标记，分布于6 个连锁群上，总长度为1 439 cM，平均遗传距离为0.8 cM。迄今为止，国内外研究者利用12 种遗传标记共构建了24 个蚕豆遗传连锁图谱（周仙莉 等，2021）。蚕豆遗传连锁图谱的饱和度不断增加，为重要农艺性状相关基因的精确定位奠定了基础（张红岩，2018）。

2.2 分子标记辅助育种

蚕豆传统育种以系统选育和杂交选育为主（杜敏敏 等，2017），利用分子标记辅助选择可以从DNA 水平对目标性状的基因型直接选择，大大提高育种效率（Gnanasambandam et al.，2012；杨梦婷 等，2019）。Avila 等（2006）采用候选基因法开发了首个适合蚕豆生长习性选择的CAPS 标记。Khazaei 等（2017）开发了1 个与蚕豆嘧啶葡糖苷及伴蚕豆嘧啶核苷含量相关基因紧密连锁的KASP 标记，为培育低抗营养因子的蚕豆品种奠定了基础。非生物胁迫是限制蚕豆产量的主要因素（Khazaei et al.，2021），利用分子标记辅助选择法选育抗逆性强的蚕豆品种有较多报道（Maalouf et al.，2019）。Ali 等（2016）利用SNP 和AFLP 对蚕豆的耐旱和抗冻性进行了关联分析，为选育耐旱抗冻性蚕豆新品种奠定了基础。国内蚕豆分子标记的研究开展较晚，田莹莹（2018）利用蚕豆品种云122 和TF42 作亲本杂交形成的F2群体构建遗传连锁图谱，定位到与蚕豆籽粒性状连锁的分子标记，为籽粒性状的遗传改良提供了基础。刘玉玲等（2022a）利用132 对SSR 标记对260 份蚕豆资源的遗传多样性进行分析，检测到与淀粉含量极显著关联的8 个标记。辛佳佳等（2022）结合22 个主要农艺性状与8 个SSR 标记对57 份江西蚕豆材料进行遗传多样性分析，筛选出了4 份优质资源。刘玉玲等（2022b）利用76 个SSR 标记对321 份蚕豆种质资源进行基因分型，发现与17 个主要农艺性状相关联的SSR 位点389 个，其中优异等位变异7 个，并筛选了7 份优异资源。

2.3 遗传多样性分析

种质资源的遗传变异丰富度是品种改良及基因资源发掘与利用的基础（Abid et al.，2015）。研究初期主要采用农艺性状的变异系数确定遗传变异度，随着测序技术的发展，分子标记被应用到蚕豆遗传多样性分析中。Link 等（1995）利用RAPD标记对3 组蚕豆自交系（13 个欧洲小种子系、6 个欧洲大种子系和9 个地中海系）资源进行分类和杂种优势群鉴定。Kwon 等（2010）利用TRAP 标记检测151 份从国内外收集到的蚕豆资源，发现地方品种异交率高，存在较大的变异。Alghamdi 等（2012）首次采用SRAP 标记对58 个蚕豆基因型之间的遗传关系和遗传多样性进行分析，结果显示地方品种依据其起源进行聚类，而其他品种则根据种子类型进行分簇。侯万伟和张小娟（2021）利用SRAP 标记分析12 份蚕豆材料，发现不同地区的资源存在较大差异，即使来自相同地区的资源亲缘关系也较远，存在丰富的遗传多样性。Ouji等（2012）利用特异序列扩增多态性（sequencespecific amplification polymorphism，SSAP）标记检测9 个突尼斯蚕豆种群的遗传多样性，发现当地主栽蚕豆Batata 种群与其他8 个种群区别明显。Zong 等（2009）采用AFLP 标记比较204 份国内和39 份国外秋蚕豆种质材料，发现这些资源分属两个基因库，中国秋蚕豆资源单独形成1 个基因库，其他地区来源的蚕豆资源形成另一个基因库，而云南蚕豆资源与我国其他省份秋蚕豆资源又有明显区别。Zong 等（2010）又利用AFLP 标记分析39 份国内和136 份国外春蚕豆材料，将这些资源分为4 个基因库，发现国内外春蚕豆资源区别明显，遗传多样性与来源地的生态环境有关。Gol等（2017）利用32 对SSR 引物将255 份蚕豆种质资源分为两个亚群，发现地方品种和栽培品种的遗传多样性没有显著差异。Neda 等（2021）利用ISSR 标记对96 份来自埃塞俄比亚不同地区的蚕豆资源进行分析，发现不同地区来源的资源在大部分组群中均有分布，均表现出较高的遗传多样性。Mulugeta 等（2021）利用SNP 标记发现48 份来自于埃塞俄比亚的蚕豆种质资源存在较高的遗传多样性。

2.4 基因定位

通过分子标记定位并发掘生物胁迫抗性相关基因，促进了蚕豆抗性种质资源创新及抗病新品种培育。锈病、赤斑病、枯萎病、根腐病和褐斑病等严重影响蚕豆产量和品质，选育抗性品种是防控病害最直接的方法（李仁慧 等，2019）。Avila 等（2003）通过混合分组分析法，在抗性品系2N52和易感品系VF-176 杂交产生的F2群体中检测到3 个与抗锈病基因Uvf-1紧密连锁的RAPD 标记（OPD13736、OPI20900和OPL181032）。Ocaa-Moral等（2017）利用SNP 标记发现蚕豆2 号（Af2）、3 号（Af3）和6 号染色体中的3 个区域与枯萎病抗性相关。Faridi 等（2021）通过对秋蚕豆种质材料的关联作图分析，开发出12 个与枯萎病抗性相关的分子标记。Roman 等（2003）通过构建蚕豆遗传分离群体及QTL 分析，将与抗褐斑病的两个相关基因区段（Af1和Af2）分别定位在第3 号和第2 号染色体。蚕豆子叶颜色和单宁含量是评价蚕豆品质的重要指标，发掘并定位与这些性状紧密关联的基因，可以为改善蚕豆品质提供理论基础。Gutierrez 等（2007，2008）开发出蚕豆中与单宁缺失基因（zt-1、zt-2）紧密连锁的2 个SCAR 标记（SCC5551和SCAD16589）。Hou 等（2018）检测出1 个与单宁缺失基因zt-1紧密连锁的SSR 标记（SSR84）。Zanotto 等（2020）利用176 个Disco/2 ×ilb938/2 杂交F6重组自交系在蚕豆3 号染色体上检测出1 个与单宁缺失基因zt2相关的SNP 位点（Vf_Mt7g100500_001），并利用该位点开发出1个KASP 标记。沙伟超（2017）基于黄绿子叶蚕豆杂交构建的F2遗传群体，利用混和分组分析法鉴定到9 个与子叶颜色紧密连锁的SSR 标记，并将控制子叶颜色的基因初步定位在LG5上。秋蚕豆的抗寒性高低决定幼苗能否顺利越冬，Ahmed 和Regina（2016）鉴定出与秋蚕豆幼苗返青和脂肪酸含量相关的3 个RAPD 标记（F15_467、I10_661、E20_1556），为蚕豆抗霜冻品种培育提供了基因资源。Sallam 等（2016）通过QTL 定位和全基因组关联分析，在101 个重组自交系和189 个不同基因型的单粒传后代中检测到1 个与抗冻相关基因紧密连锁的SNP 标记（VF_Mt3g086600）。干旱是限制蚕豆产量的重要因素之一，其生殖生长期对水分亏缺相较其他食用豆类更加敏感（Xia，1994）。Khazaei等（2014）利用211 个蚕豆重组自交系，参考蒺藜苜蓿的SNP 在蚕豆中检测到15 个与气孔特性相关的QTL，将8 个抗旱候选基因定位在蚕豆的2 号染色体。

3 展望

随着分子生物学的快速发展，蚕豆遗传连锁图谱的饱和度增加明显。然而分子标记的种类不多，其中，SSR、AFLP 和ISSR 等二代标记仍然是蚕豆遗传图谱构建和种质资源评价常用的标记技术。随着蚕豆全基因组序列的发表，将会开发更多覆盖全基因组的分子标记，对促进蚕豆分子遗传学研究和种质创新有重要意义。

种质资源的遗传多样性是加速作物育种改良的重要物质基础。由于没有发现蚕豆的直系野生种，且种间杂交不成功，蚕豆种质创新进展较慢。然而我国蚕豆的种植区域较广，在长期的隔离环境下不同生态类型的蚕豆资源形成了具有特殊遗传背景的资源群体。因此，充分利用蚕豆地方品种中存在的具有特殊价值的变异类型，对改良蚕豆品种和创新种质具有重要意义。首先，今后应适当加大对国内外蚕豆资源的引种力度，对具有代表性的种质资源进行系统分析和详细比较研究。其次，将春蚕豆与秋蚕豆资源结合，根据市场多元化需求，培育适于机械化、品质优良的加工型蚕豆新品种。再次，开发组学技术和新型分子标记辅助选择的技术体系，构建蚕豆核心种质的分子信息库，进行基因精细定位和功能研究，提高产量和抗性改良育种。