苯酚-硫酸法测定消渴丸中多糖含量*

黄秋凌 雷 婷 何子昕 宁 娜 陈新阳 林瑞珍 党 蕾△

1广州白云山中一药业有限公司时尚中药研究院,广州 510530

2广东省中医院药学部,广州 510120

消渴丸是由葛根、地黄、黄芪、天花粉、玉米须、南五味子、山药等7味中药和格列本脲组成的中西药复合制剂,具有滋肾养阴、益气生津之功效。消渴丸中所含地黄、黄芪、玉米须和葛根富含多糖成分,经现代药理学研究证明其具有调控血糖的作用[1-2]。但目前对消渴丸中多糖的研究或含量测定尚无报告,因此本研究对消渴丸中多糖含量的测定条件进行探究。本研究主要利用多糖含量测定中最常用的苯酚-硫酸法[3-4],对消渴丸中多糖含量的测定条件进行优化,并对该方法的精密度、重复性、加样回收率等进行研究,以期建立快速、准确的消渴丸中多糖含量的测定方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

主要实验仪器:Cary100 UV-VIS紫外分光光度计(安捷伦科技中国有限公司);TG16-WS台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);Milli-Q超纯水系统(密理博中国有限公司);ZKF030电热真空干燥箱(广州沪瑞明仪器有限公司);电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司);Sartorius BS 224 S型十万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司);METTLER TOLEDO XP26百万分之一电子天平(梅特勒-托利多国际贸易上海有限公司)。

消渴丸粉末由广州白云山中一药业有限公司生产提供,生产批号:XS0001、XS0002、XS0003、X01051、X01052、X01053;D-无水葡萄糖购自于中国食品药品检定研究院,批号:110833-201707;无水乙醇、浓硫酸、苯酚等均为分析纯;蒸馏水由实验室自制。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制 取烘干至恒重的D-无水葡萄糖标准品5 mg,精密称定,置于50 mL容量瓶中,加蒸馏水溶解并稀释到刻度,摇匀即得每毫升含葡萄糖0.1 mg的对照品。

1.2.2 样品前处理 称取消渴丸粉末和量取无水乙醇以1∶40(g:mL)的料液比,在90℃水浴中加热回流提取1 h,静置15 min,以4500 rpm离心10 min,过滤,将上清液转移至100 mL容量瓶中,残渣中加入30 mL蒸馏水后充分摇匀,随后置于90 ℃水浴中加热回流1 h,再以4500 rpm离心10 min,过滤;合并上清液,加蒸馏水定容至刻度,摇匀。精密量取上述溶液2 mL于离心管中,向离心管中加入18 mL无水乙醇,充分混匀,于4 ℃静置1 h,以4500 rpm离心15 min,弃上清液;再向离心管中加入10 mL 95%乙醇溶液,充分混匀,以4500 rpm离心15 min,弃上清液,沉淀中加入热水10 mL溶解,并转移至10 mL容量瓶中,定容至刻度,摇匀,作为供试品溶液。

1.2.3 标准曲线制作 精密吸取1.2.1中制备的标准溶液0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL置于25 mL具塞玻璃试管中,分别加蒸馏水补至2.0 mL,加入1.0 mL 5%苯酚溶液及5.0 mL浓硫酸溶液,混匀,置于80 ℃水浴中加热15 min,取出,放置冷却至室温。以水为参照,于490 nm波长处测定吸光度值,平行测定3次。以葡萄糖浓度(C)为横坐标,吸光度值(A)为纵坐标,绘制标准曲线,得出回归方程和计算相关系数(R2)。

1.2.4 测定方法 精密吸取供试品溶液1.0 mL于具塞玻璃试管中,加水补至2.0 mL后,按照标准曲线的制备方法及测定条件,测定供试品的吸光度值。

1.2.5 精密度实验 取X01053批次的消渴丸粉末1.0 g,共6份,精密称定,按1.2.2制备及1.2.4测定方法测定吸光度值。根据1.2.3中标准曲线的回归方程计算出供试品中的多糖浓度(C)和其相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.2.6 重复性实验 取6批次(XS0001、XS0002、XS0003、X01051、X01052、X01053)的消渴丸粉末各1.0 g,精密称定,按1.2.2制备及1.2.4测定方法测定吸光度值,平行测定3次,根据1.2.3中标准曲线的回归方程计算出供试品中的多糖浓度(C)和其RSD。

1.2.7 加样回收率实验 取X01053批次的消渴丸粉末1.0 g,共6份,精密称定,按1.2.2制备及1.2.4测定方法测定吸光度值,平行测定3次,根据1.2.3中标准曲线的回归方程计算出供试品中的多糖浓度(C),并计算其所含多糖质量。另取6份上述已制备的消渴丸多糖供试样品液1.0 mL,分别加入浓度为1000 mg/mL的葡萄糖溶液2.4 mL,平行测定3次,按1.2.4测定方法测定吸光度值,根据1.2.3中标准曲线的回归方程计算出供试品中的多糖浓度(C)后,计算加样回收率和其RSD。加样回收率=[(测得混合后供试样品液所含多糖质量-测得供试样品液所含多糖质量)/加入葡萄糖质量]×100%。

2 结果

2.1 最大吸收波长检测结果

根据实验方法,在紫外-可见分光光度计上200 nm～800 nm范围内扫描吸收曲线,测得消渴丸多糖溶液的最大吸收波长在490 nm。

2.2 标准曲线制备及线性考察

以葡萄糖浓度(C)为横坐标,吸光度值(A)为纵坐标,绘制标准曲线。测定相关数据见表1,绘制图见图1。标准曲线:A=15.443C-0.0042,R2=0.9999。葡萄糖浓度在0～0.0510 mg/mL范围内与吸光度值之间呈现良好的线性关系。

表1 标准曲线建立相关数据

图1 标准溶液曲线图

2.3 精密度考察结果

计算测得浓度的精密度实验RSD值为0.90%,见表2。

表2 精密度实验结果

2.4 重复性考察结果

计算测得浓度的重复性实验RSD值为1.38%,见表3。

表3 重复性实验结果

2.5 加样回收考察结果

经测定,该方法的平均加样回收率为98.77%,RSD值为3.25%。见表4。

表4 X01053批次的加样回收率实验结果

3 讨论

消渴丸由古代经典名方“消渴方”和“玉泉散”化裁而来,用地黄、山药、五味子以滋养肺阴、胃阴、肾阴,山药、五味子配黄芪以补益肺气、胃气,又有固肾摄精之功,地黄配天花粉、玉米须、葛根以清肺热、胃热而生津[5]。经现代药理学研究发现,组方中多种药物具有调控血糖的作用[1-2]。消渴丸作为中西药复合制剂,其中的格列本脲能更好地提高组方中中药部分的降糖效果,实现中西药合理配伍[6-7]。

前期的研究主要关注消渴丸中的小分子化合物在协同降糖中的作用和机制[8],并针对消渴丸中多个小分子化合物构建了定量测定方法[9-10]。目前,多糖作为天然降糖物质受到专家学者的重点关注[11-12],消渴丸中所含药材如地黄、黄芪、玉米须和葛根中的多糖成分,已被证实具有良好的调控血糖作用,然而尚缺乏对消渴丸中多糖成分的含量测定研究。

本研究通过苯酚-硫酸比色法测定消渴丸中多糖含量,选择最大的吸收波长,建立吸光度值-葡萄糖浓度的线性回归方程,并进行精密度实验、重复性实验和加样回收实验。结果显示,最大吸收波长为490 nm,吸光度值-葡萄糖浓度的线性回归方程:A=15.443C-0.0042,相关系数为R2=0.9999,线性范围为0～0.0510 mg/mL。精密度实验平均吸光度值为0.3656,RSD为0.90%,表明仪器精密性良好,检测结果的随机误差较小;重复性实验平均吸光度值为0.3796,RSD为1.38%,表明该方法重复性稳定,检测结果的随机误差较小;平均加样回收率98.77%,RSD为3.25%。

综上,通过精密度实验、重复性实验、加样回收率实验,表明采用苯酚-硫酸法测得的消渴丸中多糖含量准确度高、精密度良好、重复性稳定、加样回收率高,适用于消渴丸中多糖含量的测定。