舍曲林对创伤后应激障碍大鼠海马炎症反应的保护作用

唐铭杨 柳 坤 杨 澈 葛章蕾 鞠卓非 张连双 赵 伟

1 滨州医学院第二临床医学院 山东 烟台 264003;2 滨州医学院第一临床医学院 山东 滨州 256603;3 滨州医学院基础医学院 山东 烟台 264003

创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder,PTSD)是对重大灾害、战争、恐怖事件、交通意外等严重应急事件的一种精神异常反应,是应激相关性疾病中最为常见的一种[1]。PTSD 典型临床表现主要包括反复发生的闯入性创伤事件再体验及记忆异常,持续逃避回忆及反应麻木,警觉性增高和负性认知的改变等[2]。近年来,随着社会竞争压力不断增强,战争、社会暴力及自然灾害等事件的多发,PTSD 发病率不断升高,对患者的工作、生活以及社会功能等造成严重影响,如何有效治疗PTSD成为目前研究的重点之一[3]。作为应激反应的调节中枢,大脑海马与PTSD的发病密切相关。PTSD患者的海马体积缩小[4]。炎症反应与许多神经系统疾病发展密切相关。作为压力相关性蛋白,促炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)表达增强,过量的炎性因子进一步引起氧化应激反应增加,从而导致继发性神经系统损伤[5]。PTSD 大鼠海马组织会发生神经元自噬的调节作用,当细胞坏死或受损时,核内的高流动性组蛋白 B1(high mobility group box1,HMGB1)可释放到胞外,引发单核巨噬细胞分泌促炎性细胞因子[6]。

脑损伤患者体内5-羟色胺(5-hydroxytrptamine,5-HT)含量的下降导致抑郁、注意力难以集中、疲惫等症状[7]。舍曲林是被美国FDA批准为临床抗PTSD的一线药物之一。它是一种成熟的抗抑郁药物,能选择性地抑制神经元摄取5-HT,从而增加突触间隙的 5-HT 浓度,增强其对突触后膜受体的作用,进而改善抑郁情绪[8]。它具有疗效好、副反应少等优势。但其是否可通过抑制炎症反应发挥抗PTSD 作用,目前尚不明确。本研究通过观察舍曲林对PTSD大鼠的保护作用,探讨其与炎症反应的关系及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 30只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、PTSD模型组、PTSD+舍曲林组,每组10只。大鼠体质量150～200 g(购自山东鹏悦实验动物有限公司),12 h昼夜明暗交替,自由饮水摄食,适应性饲养7 d后开始实验研究。

采用国际公认的单一连续应激(single prolonged stress, SPS)法构建PTSD大鼠模型[9]。SPS操作步骤如下:将大鼠于塑料瓶中禁锢2 h后,立即强迫游泳20 min;大鼠休息15 min后,用乙醚麻醉直至其意识丧失,待其自然苏醒后,无干扰常规饲养。正常对照组:不给予任何处理;PTSD模型组大鼠制作PTSD模型后常规饲养直至取材;PTSD+舍曲林组制作大鼠PTSD模型后立即给予舍曲林15 mg/(kg·d)灌胃治疗,连续7 d。7 d后所有大鼠行高架十字迷宫检测,后立即腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉,所有大鼠心脏采血,用于ELISA检测;随后每组5只心内灌流固定,取全脑制作石蜡切片,用于TUNEL染色和HE染色;每组剩余5只直接断头取脑,冰上分离海马,用于蛋白免疫印迹检测。

1.2 高架十字迷宫检测 高架十字迷宫是评价啮齿类动物焦虑反应的实验方法,能直观反映动物的条件应答。迷宫顶部安置摄像机记录大鼠在高架十字迷宫中的行为活动。大鼠在开臂、闭臂的滞留时间及其进入开臂、闭臂的次数均被记录,时间为5 min。计算大鼠的开臂滞留时间占总时间百分比(%)及开臂进入次数占总进臂次数百分比(%),以此来评估大鼠的焦虑反应。开臂滞留时间百分比及进入次数百分比越低,表示大鼠进入开臂的探索越少,或者“焦虑”更严重。

1.3 原位缺口末端标记法(TUNEL)染色 大鼠(每组5只)麻醉后,行心内灌流固定取全脑,用4%多聚甲醛后固定24 h以上,常规石蜡包埋、制备连续切片(4 μm)。按TUNEL试剂盒(Roche公司,德国)说明书操作,DAPI染色、甘油封片后,在荧光高倍显微镜(Olympus BX53,日本)下观察海马CA1区凋亡神经元,绿色荧光显示为凋亡神经元核。每张切片随机选取5个视野计数,求平均值,并计算凋亡率。海马神经元凋亡率(%)=凋亡神经元数/神经元总数×100%。

A.开臂滞留时间占总时间百分比;B.开臂进入次数占总进臂次数百分比。与正常对照组比较,*P<0.05;与PTSD模型组比较,#P<0.05

1.4 苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色 制备连续石蜡切片(方法同上),使用HE方法染色并摄片,应用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件观察大鼠双侧海马CA1区形态结构变化。

1.5 酶联免疫吸附法检测(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 大鼠(每组10只)麻醉后心脏采血,随即将血液注入10 mL离心管中。冰冻离心机4°C下以3 000转/min的速度离心15 min以分离血清,于-80°C冻存备用。对各组血清样本按ELISA试剂盒(Elabscience公司,中国)说明书要求进行操作,分别检测其中TNF-α和IL-1β的含量。

1.6 蛋白免疫印迹检测 大鼠(每组5只)麻醉后断头取脑,依据大鼠脑立体定位图谱于冰上快速分离双侧海马组织,加入RIPA裂解缓冲液提取蛋白,使用BCA蛋白检测试剂盒测定各样本的蛋白浓度,样本存于-80°C备用。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白裂解物,转膜,室温下封闭液中震荡1.5 h,一抗(兔多克隆HMGB1抗体,英国Abcam公司,1∶5 000;兔多克隆TNF-α抗体,碧云天生物技术有限公司,1∶1 000;兔多克隆IL-1β抗体,碧云天生物技术有限公司,1∶800)4°C孵育过夜。TBST洗膜后,用HRP标记的二抗(武汉三鹰生物技术有限公司,羊抗兔IgG,1∶8 000)室温孵育1 h,充分洗涤后ECL显色。利用天能GIS凝胶成像系统对免疫印迹条带进行蛋白水平半定量分析,测量各条带的光密度(OD)值。每组实验至少重复3次,取平均值。目的条带与内参照β-actin平均OD值的比值表示蛋白相对水平。

2 结果

2.1 高架十字迷宫评估大鼠行为学变化 高架十字迷宫是利用实验动物对未知环境的探究特点,来评估其焦虑性。大鼠进入高架十字迷宫后会主动探索开臂的环境,但又惧怕高悬开放的空间。结果表明,与正常对照组比较,PTSD模型组大鼠的开臂滞留时间百分比(开臂滞留时间/总时间,图1A)和开臂进入次数百分比(开臂进入次数/总进臂次数,图1B)均显著降低(P<0.05),表明大鼠的探究行为减少;而给予PTSD大鼠舍曲林治疗后,其探究行为比PTSD模型组明显增加(P<0.05),焦虑反应减轻。

2.2 TUNEL法检测大鼠海马神经元凋亡 正常对照组、PTSD模型组、PTSD+舍曲林组海马神经元凋亡率分别为(0.17±0.05)%、(23.53±4.31)%、(13.33±2.65)%。正常对照组大鼠海马区少见TUNEL阳性神经元(图2A),凋亡率较低,而PTSD模型组TUNEL阳性神经元明显增多(图2B),凋亡率显著升高(P<0.05);与PTSD模型组相比,PTSD+舍曲林组TUNEL阳性神经元明显减少(图2C),凋亡率显著降低(P<0.05)。

A:正常对照组;B:PTSD模型组;C:PTSD+舍曲林组。红色箭头所示为TUNEL阳性神经元

2.3 HE染色观察大鼠海马形态变化 正常对照组大鼠海马神经元染色均匀,胞核大而圆,细胞间质完整(图3A、D);与正常对照组比较,PTSD模型组大鼠海马神经元排列紊乱,体积变小,胞核固缩较多,细胞间质疏松(图3B、E);给予PTSD大鼠舍曲林治疗后,海马神经元排列明显较整齐,且核固缩现象减轻(图3C、F)。

A、D. 正常对照组;B、E. PTSD模型组;C、F. PTSD+舍曲林组。红色箭头所示为核固缩、退化神经元。

2.4 ELISA检测大鼠血清中促炎性细胞因子水平 与正常对照组相比,PTSD模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平均显著升高(P<0.05);而给予舍曲林治疗后,PTSD大鼠血清TNF-α、IL-1β水平均显著降低(P<0.05)。见图4。

A.大鼠血清中TNF-α水平;B.大鼠血清中IL-1β水平。与正常对照组比较,*P< 0.05;与PTSD模型组比较,#P< 0.05。

2.5 蛋白免疫印迹法检测大鼠海马组织中炎性因子的表达 与正常对照组比较,PTSD模型组中HMGB1、TNF-α及IL-1β蛋白表达均明显上调(P<0.05);与PTSD模型组比较,PTSD+舍曲林组中HMGB1、TNF-α及IL-1β蛋白表达均显著降低(P<0.05)。见图5。

A. HMGB1的代表性蛋白免疫印迹结果及其相对蛋白表达水平;B. TNF-α的代表性蛋白免疫印迹结果及其相对蛋白表达水平;C. IL-1β的代表性蛋白免疫印迹结果及其相对蛋白表达水平。与正常对照组比较,*P<0.05;与PTSD模型组比较,#P<0.05。

3 讨论

PTSD是一种全球流行的精神障碍,也是应激相关疾病中最为典型的一种。目前PTSD发病率较高,其终身患病率为1.3%～12.2%[10],高危人群的发病率甚至可达58%[11]。除核心症状外,焦虑、抑郁等精神障碍也是PTSD临床症状之一,因此焦虑缓解可作为评价PTSD疗效的一个重要指标[12]。本研究采用单一连续应激方法构建了PTSD大鼠模型,在造模后连续7 d给予其舍曲林药物治疗。结果显示,通过高架十字迷宫评估,PTSD大鼠的焦虑反应明显强于正常对照组,而给予舍曲林治疗的PTSD大鼠焦虑反应明显减轻。提示舍曲林可改善PTSD的焦虑症状,对其治疗有较好效果,这与报道[13]一致。应激情况下海马脑区的变化与PTSD抑郁、焦虑等密切相关。海马结构紊乱与功能失调与PTSD病理进程有着十分重要的联系[14]。本研究表明,与正常对照组比较,PTSD大鼠海马区形态结构紊乱,且凋亡神经元明显增多,而给予舍曲林治疗的PTSD大鼠海马结构明显改善,凋亡神经元也显著减少。这提示舍曲林可改善PTSD大鼠海马形态结构变化,对其症状缓解起到重要作用。

PTSD的发生发展可能是压力应激下的一种炎症反应。促炎性细胞因子如 TNF-α会产生神经毒性,引起脑水肿、运动和认知障碍,调节其他组织代谢活性并促使其他细胞因子的合成和释放[15-18];IL-1β作为一种关键的促炎性细胞因子,参与多种自身免疫性炎症反应和多种细胞活动,包括细胞增殖、分化和凋亡,也参与神经保护、组织重塑和修复[19-20]。本研究发现,与正常对照组比较,PTSD大鼠血清中促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β水平均显著升高,给予其舍曲林治疗后,这两者水平则显著降低。这提示,舍曲林可减少PTSD大鼠体内促炎性细胞因子的释放,TNF- α、IL-1β血中水平与 PTSD 的发生发展密切相关。HMGB1 是一种丰富的胞核和胞质蛋白,存在于哺乳动物细胞中。传统上它被称为 DNA 结合蛋白,在稳定核小体结构、调控转录因子及 DNA 的复制、修复和重组中发挥重要作用,是炎症反应的核心成分[6]。本研究显示,与正常对照组比较,PTSD大鼠海马组织中HMGB1及TNF-α、IL-1β蛋白表达均明显上调,给予其舍曲林治疗后,海马中HMGB1及TNF-α、IL-1β蛋白表达则显著减弱,提示舍曲林可抑制PTSD大鼠海马炎症反应。使用 HMGB1 抑制剂可维持创伤性脑损伤小鼠的血脑屏障功能,减少颅内促炎性细胞因子如 TNF-α、IL-6、IL-1β的释放,减轻脑水肿程度的同时具有神经保护作用,能减少细胞凋亡并改善其功能[21]。这与本研究结果基本一致。

综上所述,舍曲林通过抑制PTSD大鼠海马炎症反应,减少促炎性细胞因子的释放,抑制海马区细胞凋亡,有助于减轻神经组织的进一步损伤,改善大鼠的焦虑反应,从而发挥对PTSD的保护作用。