IL-10、TNF- α、IFN-γ、IL-4在大鼠肝纤维化早期诊断中的意义

马丽娜 马莲环 乔卫卫 真晓雯 张乃丽

1 滨州医学院第二临床医学院 山东 烟台 264003;2 滨州医学院基础医学院 山东 烟台 264003

肝纤维化是慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段和早期阶段,而炎症反应和肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)的激活是肝纤维化的第一步[1-3]。在各种损肝因素作用下,肝细胞发生损伤、坏死及炎症反应,激活的细胞因子刺激HSCs活化并向肌成纤维样细胞(myofibroblast-like cells,MFBLC)和成纤维细胞(fibroblasts,FC)转化,导致大量细胞外基质的合成[4]。另一方面,细胞外基质的降解减少,合成与降解的不平衡促进了肝纤维化形成。肝纤维化进展为肝硬化,则难以逆转和治愈。因此,早期发现和诊断肝纤维化,及时去除病因并积极治疗,对于阻断其进展为肝硬化具有重要的意义。病理活检是肝硬化诊断的金标准,但此项检查是有创检查,可能会导致大出血等并发症,且是局部取材,不能反映肝脏整体情况,也不利于动态观察,结果的主观性亦较强,组织取样过程可能存在差错,肝脏纤维化程度可能被过高或过低估计[5-6]。

研究表明,在肝硬化的形成过程中,大量细胞因子参与了细胞的炎症损伤及修复过程[6]。根据细胞因子在炎症反应过程中的作用不同分为:致炎细胞因子和抗炎细胞因子。肝硬化往往有致炎因子和抗炎因子的过度表达或表达失衡[7]。本研究采用大鼠腹腔注射四氯化碳(carbon tetrachloride,CCL4)联合饮用硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)及5%酒精诱导12w,建立肝纤维化模型,观察促炎因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、γ 干扰素(interferon-γ,IFN-γ)及抗炎因子白细胞介素 4 (interleukin 4,IL-4)、白细胞介素10(interleukin 10,IL-10)在肝纤维化形成过程中的变化及意义,探讨其与肝纤维化的关系,探索肝硬化的病理生理学机制,并为肝硬化的临床诊断与治疗提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD雄性大鼠50只,平均体质量为(210±20)g,由济南朋悦动物公司提供。

1.2 试剂 甜味素、TAA购自天津市大茂化学试剂厂,CCL4购自深圳市安泽欣科技公司,大鼠IL-4、IL-10、TNF-α及IFN-γ的酶联免疫分析(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)试剂盒,均由南京森贝伽生物科技有限公司提供,酒购自北京红星股份有限公司,10%甲醛及水合氯醛购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 模型建立 适应性饲养3 d后,将大鼠随机分为实验组和对照组,各25只,均给予标准鼠粮喂养。实验组采用56°的白酒配制成含5%酒精、0.03%TAA和0.4%甜味素的液体,做为唯一饮用水;对照组饮用自来水。第1～4周,实验组腹腔注射50% CCL4大豆油溶液,0.5 mL/100 g,每周两次;第5周开始,实验组按0.3 mL/100 g腹腔注射50%CCL4大豆油溶液,每周两次。对照组给予等量生理盐水,注射次数相同,共计12周,每次注射前称重。在造模2、4、6、8、12周时,随机选择实验组5只,对照组5只大鼠,水合氯醛腹腔内麻醉后,心脏采血,留取肝右叶部分肝脏,10%甲醛溶液固定,石蜡包埋,染色,观察大鼠肝脏病理学改变。研究过程中,对照组大鼠死亡1只,实验组大鼠死亡 5只,分别按组别补充。

1.3.2 HE染色 石蜡包埋,4 μm厚度切片,常规程序进行HE染色,显微镜下观察。

1.3.3 测定方法 血液经3 000 r/min 离心 20 min,吸取血清,采用双抗体夹心ELISA法检测血清IL-4、IL-10、TNF-α及IFN-γ的水平,严格按照说明书操作。

2 结果

2.1 大体观察 正常对照组、造模处理2及4周的大鼠肝脏呈暗红色,表面光滑,质地柔软,边缘尖锐。此后,大鼠肝脏颜色逐渐变浅,质地变硬,且随时间延长,边缘变得越来越圆钝,各叶间结缔组织内可见脂肪组织填充。建模第6周,肝脏体积明显增大,颜色变浅呈肉红色;建模第8周,肝脏体积大,呈肉红色,边缘发钝,表面粗糙,可见灰白色触之质硬小结节;建模第12周,肝脏体积较前萎缩,颜色晦暗红色,表面凹凸不平,表面及切面散在多发灰色结节,部分呈黄褐色或黄绿色(图1)。

A．对照组;B.建模2周;C.建模4周;D.建模6周;E.建模8周;F.建模12周。

2.2 组织学观察 HE染色发现,对照组大鼠肝细胞呈多边形,细胞大小一致,细胞核大而圆,位于细胞中央,细胞质均匀,以中央静脉为中心呈放射状整齐排列,呈条索状,肝细胞内无脂滴沉积,肝窦无狭窄,小叶及汇管区无炎细胞浸润。实验组建模第2周,可见肝细胞肿胀,少量肝细胞脂肪变性,肝窦扩张充血,肝索拥挤变形。建模第4周,镜下可见肝细胞肿胀变大,细胞界限不清,细胞核大小不等,双核细胞增多,肝索拥挤,肝窦结构受压扭曲、狭窄、闭塞。可见肝细胞坏死,核浓缩、碎裂、溶解,呈小灶性,门管区有大量炎症细胞浸润,以淋巴细胞为主;建模第6周,肝细胞脂肪变性加重,以门管区较明显,细胞内脂滴以大、中泡性脂滴为主,细胞核被挤压居边,细胞界限不清;建模第8周,肝细胞变性和坏死加重,小叶周围明显,并出现淤胆,肝细胞索结构破坏,细胞排列紊乱,门管区可见较多炎症细胞浸润及纤维组织增生,并向小叶内伸展,有不完整假小叶形成;建模第12周,假小叶周围成纤维细胞增生,中央静脉偏位、缺如,肝索紊乱,汇管区肝细胞脂肪变性,淋巴细胞浸润,可见完整假小叶形成(图2)。

A．对照组;B.建模2周;C.建模4周;D.建模6周;E.建模8周;F.建模12周。

2.3 血清细胞因子在肝纤维化进展中的动态变化 在各个观察时间点,各组大鼠血清中IL-10、IL-4、IFN-γ、TNF-α表达量如表1所示。实验组大鼠血清中细胞因子IFN-γ、IL-4、TNF-α浓度随造模时间延长,呈上升趋势,与肝纤维化程度趋势相同,与正常对照组相比,P<0.01。而IL-10浓度在造模后2周达到峰值,随后则逐渐下降,到第8周恢复到正常水平,12周时低于正常对照组(P<0.01)。

表1 血清IL-10、IL-4、IFN-γ及TNF-α在肝纤维化形成中的动态变化

3 讨论

肝纤维化是肝硬化发生过程中的早期阶段,早期发现并去除病因,给予积极治疗可终止肝纤维化继续进展或逆转。早期发现肝纤维化,对肝硬化的防治具有重要的意义。

肝纤维化动物模型是开展肝硬化相关研究的重要工具。CCL4诱导的肝纤维化模型在形态学、病理生理学方面与人肝纤维化相似,是较早的广泛应用于研究的诱导肝硬化动物模型。CCL4进入体内后通过P450氧化酶激活,生成活泼的三氯甲基自由基,同时引发脂质过氧化作用,导致肝细胞变性坏死,长期反复刺激形成纤维化。但CCL4单因素诱导制备动物模型周期长,造模成功率低,复合因素可以缩短造模时间,提高成模率[8-9]。本研究采用腹腔注射50% CCL4、联合饮用0.03%TAA和5%酒精的方法,建立大鼠肝纤维化模型。TAA是一种强有力的肝毒性物质,短期接触可引起肝小叶坏死,随着接触时间的延长可导致胆管增生、肝纤维化和肝硬化[10]。肝脏是乙醇代谢的主要场所,乙醇及其代谢产物乙醛可通过多种途径损害肝脏的结构和功能,导致持续炎症反应,激活Kupffer细胞,同时乙醇还可直接损伤血管内皮,导致血小板聚集,大量细胞因子释放并相互作用,激活星状细胞,分化为成纤维细胞,合成并分泌大量的胶原并沉积致肝纤维化,甚至发展为肝硬化,与CCL4同时作用时,增强CCL4对肝细胞的毒性作用,促进肝硬化的形成[11-12]。肝纤维化模型制备成功的标准为肉眼见硬化结节,镜下见假小叶及纤维隔形成[10]。本实验组大鼠第8周肝脏出现质硬小结节,镜下见不完整假小叶;第12周见肝脏散在多发灰白色结节,镜下见假小叶形成,提示大鼠肝纤维化模型制作成功,同时证实CCL4、TAA和酒精联合诱导可快速、高效地建立肝纤维化动物模型。

肝纤维化形成过程中,促炎因子和抗炎因子的平衡被打破,且炎症反应会加重纤维化[13-14]。本研究中诱导造模2周时,TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10浓度均高于对照组,IFN-γ、TNF-α是重要的致炎因子,IL-4、IL-10是重要的抗炎因子。提示肝细胞损伤后,TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10均参与肝细胞炎症反应。随诱导时间的增加,肝细胞坏死逐渐加重,TNF-α、IFN-γ、IL-4水平逐渐升高,但IL-10降低,提示慢性持续性肝损伤存在细胞因子失衡,与文献[15]一致。肝纤维化逐渐形成,TNF-α、IL-4、IFN-γ水平增加,IL-10进一步降低,提示这些细胞因子参与了肝纤维化的形成,在肝纤维化的形成过程中发挥不同的作用。

INF-γ通过抑制肝星状细胞增殖、活化,抑制细胞外基质中蛋白的合成,包括腔隙基质蛋白(纤维连接蛋白、腱蛋白、Ⅲ型胶原)和基底膜蛋白(Ⅳ型胶原、巢蛋白、层连蛋白)的合成,促进前列腺素E2的释放以抑制胶原的合成[16],并可降解已形成的纤维,还能够减轻硬化的肝脏门静脉压力进而延缓肝硬化的进展[17]。TNF-α是作用强大的促炎因子,在肝损伤早期即发生变化,TNF-α能使Kupffer细胞激活,可刺激肝星状细胞的增殖,促进肝星状细胞产生细胞外基质,促进肝内纤维母细胞增殖,并促使其向肌纤维母细胞转化,对纤维母细胞的胶原合成有促进作用,促进肝纤维化形成。INF-γ、TNF-α同时增加,这提示两者均在肝纤维化发生发展中发挥重要作用,肝纤维化过程中,抑制因子与促进因子的活动均增强,最终发生失衡,导致纤维化逐渐加重[18]。IL-10可抑制免疫细胞的活化,具有潜在的抗炎和抗纤维化作用。在肝纤维化的形成过程中,IL-10抑制HSCs的激活,这可能与其可下调炎症细胞免疫反应及转化生长因子β(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、TNF-α和基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor metalloprotemase,TIMPs)等这些HSCs的刺激因子有关,从而减轻肝脏纤维化程度[19-20];其次,抑制细胞外基质的合成及促进其降解[21-22]。Thompson[23]研究发现肝星状细胞可能通过自分泌IL-10的形式抑制胶原的合成,抑制肝损伤炎症反应,进而延缓肝纤维化的进程。IL-10持续降低,提示在肝纤维化进展过程,抗炎及抗纤维化的能力虽然早期增强,但随病程进展逐渐减低。

IL-4促进肺、皮肤和肝脏等各种器官的纤维母细胞增生和细胞外基质产生,并诱导TGF-β1产生,从而强化胶原蛋白I、Ⅲ型、纤连蛋白和肌腱蛋白合成[24-26]。另外,IL-4还是强有力的成纤维母细胞趋化因子,可诱导肝Kupffer细胞转变为多核巨细胞,并刺激肝星状细胞增殖[27]。IL-4可能通过增加胶原合成和抑制细胞增殖直接作用于肝星状细胞。IL-4增加提示其促进了肝纤维化[28-29]。

综上所述,CCL4、TAA和酒精联合诱导是制备大鼠肝纤维化模型的有效方法,在肝纤维化形成过程中存在炎症细胞因子与抗炎细胞因子的表达过度和失衡。细胞因子参与免疫炎症反应,同时促进了肝纤维化的进展,血清中TNF-α、IFN-γ、IL-4表达水平随肝纤维化程度加重而逐渐升高,对肝纤维的诊断有一定的参考价值。