原花青素B2软膏对UVB诱导BALB/c-nu小鼠皮肤光老化的防治效果

李 岚 李燕妮

1 滨州医学院基础医学院医学遗传学与细胞生物学教研室 山东 烟台 264003;2 滨州医学院药学院生物制药工艺与制剂教研室 山东 烟台 264003

皮肤是人体最大的器官,并作为人体的第一道防线,保护着人体免受外界各种刺激因素的侵袭。但与此同时,它也是最容易受外界环境影响的器官,风吹日晒等均可导致皮肤受损。皮肤光老化也称外源性老化,主要由紫外线照射造成,是引起皮肤衰老的重要原因之一,表现为皮肤粗糙暗沉,严重者出现皱纹红斑等情况[1]。近年来,随着臭氧层减少,由紫外线照射引起的光老化现象也日益严重,致使光老化在当代已经成为研究热点。为了寻求对皮肤更安全有效的防晒剂,近年的研究倾向于开发天然药物和食物提取物在应对皮肤光损伤、预防光老化方面的潜在作用[2]。

原花青素B2(procianidin B2, PCB2)是存在于葡萄籽、火龙果、樱桃等含有花青素食物中的主要活性成分,其结构中含有单体儿茶素,通过C4-C8磺烷键聚合为二聚体,具有较强的生物活性[3-4]。基于多酚类物质广泛的抗氧化活性和抗炎活性,研究结果表明口服或外用植物花青素可提高抗氧化酶活性,清除ROS,修复DNA损伤,抑制炎症因子的表达,从而达到保护皮肤免受紫外线损伤的作用[5]。

随着生活水平的显著提高,人们对于“老而不衰,形神俱美”的目标追求愈发强烈。原花青素B2作为一种天然来源的黄酮类化合物,本研究以BALB/c-nu小鼠为实验动物,对小鼠涂抹原花青素B2软膏,通过建立UVB照射诱导小鼠皮肤光老化模型,观察涂抹原花青素B2软膏对小鼠皮肤组织的形态学变化,通过病理学和生化指标的检测,初步评估原花青素B2软膏抵抗小鼠皮肤光老化的效果,为开发原花青素B2软膏抗光老化的研究及其药用价值提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 原花青素B2[爱必信(上海)生物科技有限公司];苏木素伊红(Hematoxylin &Eosin,HE)染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);Masson染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);小鼠肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor, TNF-α)试剂盒(南京建成生物工程研究所);小鼠白介素6(Interleukin 6, IL-6)试剂盒(南京建成生物工程研究所);小鼠超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所);单硬脂酸甘油酯,硬脂酸,三乙醇胺等均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 正交法优选原花青素B2软膏基质 拟定三因素三水平的正交试验方案,选择单硬脂酸甘油酯用量(A)、氮酮用量(B)、硬脂酸用量(C)为考察因素,按表1进行正交水平试验,其他固定因素选用凡士林2.8 g,三乙醇胺0.2 g,羊毛脂2.1 g,尼铂金乙酯0.1 g,原花青素B2粉末0.5 g,加蒸馏水至总量50 g,于70 ℃水浴中搅拌至熔融状态[6-7]。将水相缓缓加到油相并在70 ℃继续反应10 min,室温下继续搅拌至冷凝,得到原花青素B2软膏。

表1 原花青素B2正交水平因素表

1.2.2 实验动物 购买7～8周龄健康的雄性BALB/c-nu小鼠,由杭州子源实验动物科技有限公司提供,证书编号:SCXK(浙2019-0004)。动物先在25 ℃适应性正常喂养7 d,使其逐渐适应环境,再随机分为3个大组:对照组,模型组,抹药组(每组动物6只)。在25 ℃室内环境下饲养,每天给予小鼠自由饮食与饮水。

1.2.3 光老化动物模型的建立 抹药组于每日紫外线照射前1 h涂抹原花青素B2软膏(0.5 g/只);除对照组外,其余两组小鼠进行紫外线照射处理。选用波长303 nm UVB紫外灯照射,紫外线灯管距离小鼠约25 cm,照射时间为每天20 min,每日一次,共照射14 d。于最后一次紫外线照射结束24 h内,颈部脱臼处死小鼠,剪取小鼠背部照光皮肤组织,剥离皮下脂肪及结缔组织,一部分用于组织病理学观察,另一半保存于-80 ℃冰箱用于后续生化指标的检测。

1.2.4 小鼠皮肤组织HE染色和Masson染色 将包埋皮肤的蜡块进行切片,厚度为4 μm,65 ℃烤片,二甲苯、酒精梯度脱蜡、再按照HE染色流程和Masson试剂盒说明书进行染色,最后透明、封片、显微镜下观察并拍照。

1.2.5 ELISA法检测皮肤组织中炎症因子和SOD的含量 将皮肤组织称重,按重量体积比1 g∶9 mL加入PBS(pH=7.4),使用超声破碎仪将组织充分匀浆,4 ℃,2 500 rpm离心10 min。按照ELISA试剂盒说明书进行操作,利用450 nm测定各孔吸光度值,最后根据标准曲线和蛋白浓度计算各组织中IL-6,TNF-α和SOD的含量。

2 结果

2.1 正交试验结果

由表2和3可知,B因素对处方基质的影响程度最大,最佳处方A1B2C2,即硬脂酸5.0 g,单硬脂酸甘油酯1.4 g,氮铜0.2 g,其他固定因素羊毛脂2.0 g,三乙醇胺0.16 g,尼铂金乙酯0.1 g,原花青素B2粉末0.5 g。

表2 正交试验结果

表3 方差结果分析表

2.2 原花青素B2软膏对小鼠皮肤外观的影响 如图1所示,对照组小鼠皮肤光嫩细腻,无褶皱。经UVB照射后,模型组小鼠皮肤粗糙增厚,出现红肿;因水分的减少出现褶皱增多,有红斑和脱屑现象,甚至会出现大块黄色结痂。抹药组小鼠皮肤未出现结痂和脱屑情况,光老化现象仅表现为出现红斑,褶皱现象也有所减轻。

图1 BALB/c-nu小鼠背部皮肤外观

2.3 原花青素B2软膏对小鼠皮肤组织形态学的影响

2.3.1 HE染色法观察皮肤组织 各组小鼠皮肤HE染色结果如图2所示,对照组小鼠皮肤细胞各部分层次分明,排列有序,表皮层及其内部的棘细胞层、透明层等厚度较薄;经UVB照射后,模型组小鼠皮肤出现表皮层厚度明显增高,且厚度不一致,棘细胞层变厚,表皮乳头向内增生;说明UVB诱导小鼠皮肤光老化造模成功。与模型组相比,抹药组小鼠的表皮和真皮厚度都有明显变薄,角质层变薄,真皮-表皮边界较清晰。

图2 BALB/c-nu小鼠皮肤组织的HE染色

2.3.2 Masson染色法观察皮肤组织 小鼠皮肤组织胶原纤维的变化,如图3所示。对照组小鼠皮肤真皮中含有大量被染成蓝色的胶原纤维;模型组小鼠由于皮肤受到紫外光损伤,表皮有脱落现象,胶原纤维被破坏,数量明显减少,疏松并且排列紊乱;相比于模型组,抹药组小鼠皮肤组织中被染为蓝色的胶原纤维数量明显得到改善。表明原花青素B2软膏可以在一定程度上保护皮肤胶原结构免受 UVB诱导的损伤。

图3 BALB/c-nu小鼠皮肤组织的Masson染色

2.4 原花青素B2软膏对小鼠皮肤组织炎症因子IL-6和TNF-α含量的影响 如表4所示,与对照组比较,模型组小鼠皮肤组织中IL-6和TNF-α的含量均显著增高(P<0.05);与模型组相比,抹药组小鼠皮肤IL-6和TNF-α的水平均出现降低(P<0.05)。以上结果表明原花青素B2软膏能抑制小鼠皮肤组织中炎症因子的表达,具有抗炎能力。

表4 原花青素B2软膏对小鼠皮肤组织IL-6,TNF-α含量的影响作用

2.5 原花青素B2软膏对小鼠皮肤组织SOD含量的影响 如表5所示,与对照组相比,模型组小鼠皮肤组织的SOD的含量明显下降(P<0.05,具有统计学意义);与模型组相比,抹药组小鼠皮肤组织中SOD的水平出现升高(P<0.05)。结果表明原花青素B2软膏可以通过提升抗氧化能力,增强小鼠体内的抗氧化损伤防御系统,从而发挥预防UVB诱导的皮肤光老化的作用。

表5 原花青素B2对小鼠皮肤组织中SOD含量的影响作用

3 讨论

烟台是中国海滨城市,本文研究的紫外线光老化问题是人们夏季海边游玩常发生的现象,如何预防紫外线对皮肤造成光老化成为大众关注的重点。根据波长的不同,自然光中的紫外线被分为三种类型:波长在320～400 nm之间的长波紫外线(ultraviolet A, UVA);波长在290～320 nm之间的中波紫外线(ultraviolet B, UVB);波长在100～290 nm之间的短波紫外线(ultraviolet C, UVC)。UVA是长波紫外线,生物作用比较弱;UVB是中波紫外线,不仅能引起免疫系统能力下降,而且可通过某些反应途径导致皮肤癌等皮肤疾病的产生;UVC则不能到达地球表面[8-9]。

烟台也是亚洲唯一的国际葡萄·葡萄酒城,环渤海地区出产大量葡萄酒,但葡萄籽残渣常被作为“垃圾”废弃。本文选用的研究对象—原花青素B2是从葡萄籽中提取的天然的黄酮类化合物,结合地区因素和优势,一方面开发葡萄籽原花青素B2作为天然光化学防护剂的潜在保健价值,另一方面促进葡萄籽残渣的再回收利用。紫外线是造成皮肤光老化的重要原因之一。研究发现,UVB照射会诱发表皮层出现不规则增厚,从而导致皮肤粗糙、起皱,而角质层的含水量降低是影响皮肤外观黯淡无光泽的主要原因[10-11]。本研究中BALB/c-nu小鼠经UVB照射出现皮肤粗糙、褶皱、红斑、脱屑等典型光老化现象,组织形态学表现为表皮增厚,真皮胶原纤维排列紊乱,证明UVB诱导小鼠皮肤光老化造模成功。

原花青素B2特有的结构特征使它在外涂的应用中具有良好的抗氧化性以及抗衰老的作用,且其吸收过程较为简单,提示其在治疗由UVB引起的皮肤光老化问题中可能具有一定潜力[12]。由本方案制作的原花青素B2软膏易于展涂,质地均匀,具有良好的透皮吸收作用且对小鼠皮肤无刺激性。通过观察皮肤组织的外观变化,并结合病理学切片对组织形态学的检测,结果显示:涂抹原花青素B2软膏可在一定程度上减轻紫外光对皮肤外在造成的结痂和脱屑等光老化情况的出现和内在对胶原纤维的破坏,使小鼠皮肤组织得到一定程度的恢复。证明原花青素B2具备防治皮肤光老化和促进皮肤健康的作用。

目前关于皮肤老化的机制学说很多,其中自由基学说占据主导,认为组织细胞不断产生自由基是最终导致皮肤衰老的重要原因[13-14]。过量的UVB辐射会造成机体内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的大量堆积,引起蛋白质和核酸的交联聚合,形成色素或脂褐质的积累。机体内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD),过氧化氢酶(catalase, CAT)等抗氧化酶活力下降,导致自由基稳态失衡,组织损伤[15]。ROS可攻击皮肤细胞内的脂质发生过氧化反应,使组织发生大分子交联反应,损害真皮组织[16]。研究发现,在受UVB辐射的无毛小鼠背部涂抹芦丁和柚皮素可以减少UVB诱导的ROS和脂质过氧化物的产生[17]。

紫外线导致过量的自由基聚集,进而引发炎症反应,增加促炎性细胞因子TNF-α、IL-6等的生成,最终导致炎症失衡[18]。蓝莓提取物也可通过降低丙二醛的水平和抑IL-6 和TNF-α的表达,提高谷胱甘肽的水平,使小鼠免受UVB诱导的氧化应激和炎症反应的影响[19]。本研究发现,与模型组相比,涂抹原花青素B2软膏可降低小鼠皮肤组织中IL-6,TNF-α的含量,提高了皮肤组织中SOD氧化酶活性,缓解了氧化应激反应。初步表明:原花青素B2软膏可以增强与抗氧化相关的酶活力,抑制炎症因子的表达,抑制UVB诱导的皮肤光老化,强化机体的防御机能。