超声提取结合HPLC-ICP-MS联用测定富硒山茶油中的硒形态

刘文政, 贾亚琪, 周贻兵, 毕 珊, 刘利亚

(贵州省疾病预防控制中心1,贵阳 550004)(贵州省环境科学研究设计院2,贵阳 550081)

山茶油,又名油茶籽油、茶籽油、茶油等,是山茶科(Camellia)植物油茶(CamelliaoleiferaAbel)种子经压榨或浸提加工制得的食用油脂[1]。油茶是一种木本油料树种,分布在长江流域及其以南的多个省域,其中江西、湖南、广西三省的油茶种植面积占全国总种植面积的三分之二以上[2]。山茶油蕴含生育酚、茶多酚、甾醇、茶皂素和角鲨烯等多种生物活性成分[3,4]。山茶油是深受消费者欢迎的高端食用油,有“东方橄榄油”的美誉[5]。硒是人体生长发育所必需的微量元素,对防治疾病、增进健康和预防衰老具有重要意义,而人体补硒却只能从食物中摄取。目前我国绝大部分地区依然存在缺硒或严重缺硒的情况,这严重威胁着国民的身体健康,亟需大力发展富硒食品产业[6]。目前,我国油茶种植面积约453×104hm2,已有15个省份近800个县种植油茶,种植面积在6 667 hm2以上的县有200个左右,富硒茶油年总产量仅有20万t左右,茶油占国内食用油消费的比例仅为2%[6]。按照中央部署,持续推进扩大油茶种植面积、改造提升低产林,到2025年,全国油茶种植面积有望超过600×104hm2,茶油产量达到200万t,茶油占国内食用油消费的比例提高至5%,成为增强国内食用油生产保障能力、丰富食用油品种的重要支撑[7]。因此,采用施肥富硒、生物化学富硒等技术手段实现茶油富硒[8],茶油中的硒含量得以提升,使得富硒茶油具有茶油和硒的双重营养功效,进而改善了居民日常膳食中的缺硒窘境。

硒主要有亚硒酸根(Se(IV))、硒酸根(Se(VI))、硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基-硒代半胱氨酸(SeMC)、硒代蛋氨酸(SeMet) 5种赋存形态,而人体对不同赋存形态硒化合物的吸收利用效率差异显著[9-12]。采用气相色谱法[13]、高效液相色谱(HPLC)法[14]、离子色谱法[15]和毛细管电泳法[16]对硒化合物进行分离,利用原子吸收光谱法[17]、原子荧光光谱法[18]、电感耦合等离子发射光谱法[19]、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法[20-24]对硒化合物的含量进行测定。马小灵等[25]开展了富硒茶油对小鼠降血脂和抗氧化作用的影响研究,研究结果表明富硒茶油和普通茶油均有降血脂和抗氧化作用,但富硒茶油效果更好。宋亚蕊等[6]研究富硒茶油的硒含量对其品质及功能性成分的影响,研究结果显示,随着茶油中硒含量的增加,亚油酸、亚麻酸和甾醇含量显著提高,油酸含量则有所降低。针对富硒茶油的研究主要集中在营养成分、功能性成分及其抗氧化活性方面的研究,而国内外有关植物油中5种硒形态化合物的测定方法却鲜见报道。本研究建立了HPLC-ICP-MS法对富硒山茶油中5种硒形态化合物的含量进行分离测定,该方法具有分离效率高、检出限低、精密度高、稳定性好等优点,旨在为进一步开展富硒山茶油产品的高通量筛查和有效甄别工作提供技术参考,助力富硒山茶油产业的健康良性发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

恩施、宜春、高安、浏阳、衡阳、开阳、黔东南、铜仁等8个富硒山茶油样:市售;SeCys2标准物质溶液(44.2 μg/g)、SeMC标准物质溶液(34.8 μg/g)、Se(Ⅳ)标准物质溶液(42.9 μg/g)、SeMet标准物质溶液(39.4 μg/g)、Se(Ⅵ)标准物质溶液(41.5 μg/g);柠檬酸(色谱纯);蛋白酶K;其他化学试剂均为优级纯;超纯水;ICP-MS调谐液(1 μg/L)。

1.2 仪器与设备

iCAPQ型ICP-MS仪,U3000型HPLC仪,Hamilton PRP-X100色谱柱(250 mm×4.1 mm,10 μm),ME204型万分之一电子分析天平,1-15K型台式高速冷冻离心机。

1.3 方法

1.3.1 仪器工作参数

色谱条件:PRP-X100色谱柱(250 mm×4.1 mm,10 μm);流动相A:5 mmol/L柠檬酸溶液(pH 5.5);流动相B:超纯水;流动相流速:0.8 mL/min;进样量:20 μL。梯度洗脱:0～7 min,5%流动相A;8～15 min,50%流动相A;16～20 min,5%流动相A。

ICP-MS工作条件:射频功率1 550 W;雾化室温度2 ℃;载气流量0.5 L/min;辅助气流量0.1L/min。样品分析前使用调谐液将仪器灵敏度调至最佳状态。

1.3.2 样品前处理

称取约0.5 g富硒山茶油样品于15 mL塑料离心管中,加入1 mL 10 mg/mL的蛋白酶K溶液,加纯水定容至10 mL,超声提取50 min,高速离心10 min,取下层清液,过0.45 μm水相滤膜,上机测定。

2 结果与分析

2.1 优化色谱分离条件

根据王丙涛等[22]对食品中5种硒形态进行研究的报道,实验选择浓度为5 mmol/L的柠檬酸溶液(pH 5.5)作为流动相。100%流动相条件下不同硒形态目标化合物的色谱图如图1所示。采用柠檬酸溶液(pH 5.5)作为流动相进行等度洗脱,能将SeCys2、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ) 4种硒形态目标化合物的色谱峰完全分开,这与曹玉嫔等[26]对牛蒡和三七中硒形态的研究结果基本一致。采用流动相柠檬酸溶液(pH 5.5)等度洗脱无法将SeMC、Se(Ⅳ) 2种硒形态目标化合物的色谱峰完全分开。

图1 100%流动相A条件下不同硒化合物的色谱图

为了将SeMC、Se(Ⅳ) 2种硒形态目标组分的色谱峰完全分开以实现较好的分离度,本实验对流动相A的比例进行了系统优化。实验研究了流动相A比例分别为5%、10%、50%、100%时2种硒形态目标化合物的分离情况,研究结果如图2所示。随着流动相A比例的逐渐减小,SeMC与Se(Ⅳ)的分离度逐渐增大,当流动相A的比例为5%时,SeMC与Se(Ⅳ)可实现完全分离。

图2 不同流动相A比例条件下2种硒化合物的色谱图

2种不同洗脱方式下5种硒形态目标化合物的分析色谱图如图3所示。由图3a可知,采用等度洗脱方式(流动相A的比例为5%)时,5种硒形态目标化合物均能实现较好分离,SeCys2、SeMC、Se(Ⅳ)、SeMet 4种硒形态目标化合物的色谱峰7 min内可完全分开,而Se(Ⅵ)于23 min左右出峰,总的分析时长达到25 min。Se(Ⅵ)出峰时间过长,导致峰形拖尾、总的分析时长增加,这不利于实现对实际样品的快速检测。因此,本实验选择采用梯度洗脱方式,旨在不影响先出峰的4种硒形态目标化合物分离度的情况下,缩短Se(Ⅵ)的出峰时间。实验结果表明,随着流动相A比例的升高,Se(Ⅵ)的出峰时间变短。与此同时,随着流动相中盐含量的升高,导致仪器的故障发生率、维护成本升高,故在8～15 min内本研究选择采用50%流动相A进行梯度洗脱。由图3b可知,5种硒形态目标化合物在15 min内均能实现完全分离。

图3 等度和梯度洗脱方式下5种硒化合物的色谱图

2.2 优化样品前处理条件

本实验分别使用水、1%(体积分数)硝酸溶液、蛋白酶K溶液等提取剂对富硒山茶油中硒形态化合物的提取效果进行了考察。实验结果表明,采用水、1%(体积分数)硝酸溶液作为提取剂时,试样中只有少量的Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ) 2种无机硒形态目标化合物被检出,其他3种有机硒形态目标化合物均未检出;采用蛋白酶K溶液为提取剂时,试样中Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)、SeCys2、SeMC、SeMet 5种硒形态目标化合物均被检出,这可能与富硒山茶油中的硒形态化合物主要以硒蛋白等形式存在有关,有机硒形态目标化合物在水或1%硝酸溶液中的溶解度较低,这与曹玉嫔等[26]、陈贵宇等[27]的研究结果相一致。因此,选用蛋白酶K溶液作为提取试剂,继续考察超声提取时间、蛋白酶K溶液用量对总硒提取量的影响。

2.2.1 优化超声提取时间

选取超声提取时间5、10、20、30、40、50、60、80 min,每个超声提取时间点设置6个平行,研究超声提取时间与总硒提取量的关系,研究结果见图4。在一定的超声提取时间范围内,总硒提取量与超声提取时间成正比例关系。当超声提取时间高于50 min,总硒提取量的增幅趋于平缓。因此,确定超声提取时间为50 min。

图4 超声提取时间、蛋白酶K溶液用量与总硒提取量的关系

2.2.2 优化蛋白酶K溶液的用量

选取蛋白酶K用量0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mL,每个蛋白酶K用量设置6个平行,研究探讨蛋白酶K用量与总硒提取量的关系,研究结果见图4。在一定的蛋白酶K用量范围内,总硒提取量与蛋白酶K用量成正比例关系。当蛋白酶K溶液的用量大于1 mL,总硒提取量的增幅趋于平缓。因此,确定蛋白酶K的用量为1 mL。

2.3 方法学考察

分别配制质量浓度为0、5、10、20、30、40、50、80、100 μg/L的5种硒形态目标化合物的混合标准系列溶液,在优化好的实验条件下对方法学指标(线性范围、相关系数、检出限、定量限、加标回收率及相对标准偏差)进行考察,实验结果见表1、表2。由表1可知,5种硒化合物在5～100 μg/L的质量浓度范围内线性良好,相关系数R均大于0.999。

表1 5种硒化合物的标准曲线线性参数及检出限

表2 5种硒形态化合物的样品加标回收率、相对标准偏差

在空白试剂中加入5 μg/L的硒形态化合物混合标准溶液,以3倍基线噪音测定5种硒化合物的检出限,分别为SeCys20.16 μg/L、SeMC 0.23 μg/L、Se(Ⅳ) 0.20 μg/L、SeMet 0.71 μg/L、Se(Ⅵ) 1.15μg/L。取样量为0.5 g,定容体积为10 mL,5种硒形态化合物的定量限分别为SeCys20.009 6 mg/kg、SeMC 0.014 mg/kg、Se(Ⅳ) 0.012 mg/kg、SeMet 0.043 mg/kg、Se(Ⅵ) 0.069 mg/kg。分别向富硒山茶油实际样品中加入5、25、50 μg/L 3个浓度水平的5种硒形态化合物标准溶液,各自平行处理6个样品。由表2可知,扣除样品空白后,5种硒形态化合物的回收率为94.6%～113.1%,相对标准偏差(RSD)为1.86%～4.87%,均在5%以内。

2.4 实际样品的测定结果

8个不同地区的富硒山茶油样品中5种硒形态化合物的含量测定结果见表3。不同地区富硒山茶油中5种硒化合物的含量存在一定差异。宜春、铜仁富硒山茶油中含量最高的是甲基-硒代半胱氨酸,其次是硒酸盐;高安、恩施、开阳、黔东南、浏阳富硒山茶油中含量最高的是硒代蛋氨酸,衡阳富硒山茶油中含量最高的则是硒酸盐。在8种富硒山茶油样品中,宜春富硒山茶油中有机硒形态总量在总硒中的占比最高,高达72.4%。因有机形态硒化合物易被人体吸收利用,且无毒无害[22],表明宜春富硒山茶油可能更适合用于满足人们的补硒需求。

3 结论

富硒山茶油作为市场流通的常见山茶油产品,其产品中的硒形态化合物含量已引起人们越来越多的重视和关注。我国现行标准DB 61/T 508.6—2011《富硒双低菜籽油》[28](硒含量≥0.02 mg/kg)、DB 61/T 556—2018《富硒含硒食品与相关产品硒含量标准》[29](富硒食用油、油脂及其制品硒含量≥0.075 mg/kg)、DB 5115/T 17—2020《富硒农产品硒含量要求》[30](富硒油料及其副产品硒含量为0.05～0.50 mg/kg)均只明确富硒食品中总硒的最低含量要求,尚未明确富硒山茶油中硒形态化合物的最低含量,其中有机形态硒化合物由于易被人体吸收利用,且无毒害作用,常被作为人体补硒的重要食物摄入来源[22, 24-26]。因此,有必要对富硒山茶油中的硒形态化合物含量进行检测和监控。本研究建立了超声提取结合高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用测定富硒山茶油中5种硒形态化合物含量的方法。该方法前处理操作简便快速,方法检出限低,精密度及准确度良好,符合检测要求,有较强的可行性和实用性,适用于富硒山茶油中5种硒形态化合物的快速测定。