酶解-挤出复合法改性绿豆皮膳食纤维及其结构表征与理化性能

刘鸿铖, 樊红秀, 赵 鑫, 张闪闪, 刘婷婷, 王大为

(吉林农业大学食品科学与工程学院1,长春 130118)(农业农村部食用菌加工技术集成科研基地2,长春 130118)(吉林省粮食精深加工与高效利用工程研究中心3,长春 130118)(吉林省粮食精深加工与副产物高效利用技术创新重点实验室4,长春 130118)

绿豆[Vignaradiata(Linn.) Wilczek]富含多种营养成分,其中主要成分为蛋白质与淀粉,总质量分数约占绿豆籽粒的80%,同时膳食纤维(DF)、维生素、黄酮、生物碱等成分含量也相当可观[1-4]。绿豆皮是生产豆芽时产生的副产物,目前其利用方式除了少部分作为饲料加工外,大部分直接废弃,不仅未得到充分利用,而且会带来环境问题。绿豆皮的主要成分是膳食纤维(质量分数约为75%),特别适合用于生产高品质膳食纤维。

相关研究已经表明膳食纤维具有调节血糖、预防心脑血管疾病、通便等多种功效[5]。根据分类,膳食纤维有不溶性膳食纤维(IDF)和可溶性膳食纤维(SDF)2种类型,其中可溶性膳食纤维的功能活性更强[6]。由于天然产物的膳食纤维中SDF含量比较低,因其较差的口感使其没能广泛地应用在食品领域中。采用绿色高效、简约的改性方式使尽可能多的IDF转化为SDF,逐渐成为当前研究膳食纤维改性的热点[7,8]。

酶解、挤出膨化等方式在改性膳食纤维方面具有良好的效果,可使SDF的得率大幅度提高。刘婷婷等[9]研究单螺杆挤出改性处理香菇柄纤维,改性后的香菇柄纤维持水力、持油力和膨胀力均比改性前增加。李升等[10]采用CO2爆破挤出改性提升了麦麸中SDF的含量,同时显著提高了其抗氧化活性。张海芳等[11]发现酶法改性能显著提高马铃薯渣膳食纤维中的单糖含量,持水力、结合水力、持油力和阳离子交换力等理化性质也得到明显改善。酶解-挤出复合法技术是近年来新兴起的技术,要求先将物料与酶混合均匀,酶解一段时间后进行挤出处理,该技术结合了挤出过程高压、高温、高剪切力的作用,再加上酶的协同作用促使物料大幅度被降解,具有成本低、生产效率高等优点[12]。然而,目前对于酶解-挤出复合改性绿豆皮膳食纤维后结构变化的研究还鲜有报道。因此,本研究将绿豆皮膳食纤维进行酶解-挤出复合改性处理,通过扫描电镜、傅里叶近红外光谱、X-射线衍射表征酶解-挤出复合改性对绿豆皮膳食纤维结构的变化影响,以持油力、膨胀力、吸附胆固醇能力和阳离子交换能力等理化性能为考核指标,分析酶解-挤出复合改性处理对绿豆皮膳食纤维理化性能的影响,为后续提高绿豆皮膳食纤维的利用率和开发绿豆高附加值产品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

绿豆(一级),符合GB/T 10462—2008《绿豆》中一级绿豆的要求。碱性蛋白酶(3×103U/mL)、耐高温α-淀粉酶(4×104U/g)、糖化酶(1.6×105U/g)、纤维素酶(3×104U/g)。无水乙醇、溴化钾等:分析纯。

1.2 仪器与设备

GB 1302电子精密天平,TU-1901双光束紫外可见分光光度计,JC-60A单螺杆挤出试验机,MiniFlx 600台式粉末X-射线衍射仪,Nicolet is20傅里叶变换红外光谱仪,DE-CSF6膳食纤维测定仪,Phenom Pro全自动台式扫描电镜。

1.3 实验方法

1.3.1 绿豆皮的收集

参照王大为等[13]的方法,挑选籽粒饱满、表皮无破损的绿豆,移入40 ℃的温水中浸泡3.5 h,挑出死豆,将其余绿豆移入豆芽机中,在25 ℃条件下培养,每间隔0.5 h喷淋清水1次,3 d后可收集到发芽脱落的绿豆皮,至于45 ℃烘箱干燥,粉碎过80 目筛(0.20 mm)并干燥保存待用。

1.3.2 绿豆皮基础成分分析测定

水分含量:依据GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》,直接干燥法;脂肪含量:依据GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》,索氏抽提法;灰分含量:依据GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》,灼烧重量法;蛋白质含量:依据GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》,分光光度法;SDF、IDF、总膳食纤维(TDF)含量:依据GB 5009.88—2014《食品安全国家标准 食品中膳食纤维的测定》,酶重量法。

1.3.3 酶解-挤出复合法改性绿豆皮膳食纤维的制备

精确称取一定量绿豆皮粉,加入一定量的纤维素酶和水分充分混合均匀,酶解一段时间(pH 5.5、酶解温度50 ℃),经过润料搅拌均匀后,采用单螺杆挤出实验机进行改性处理。固定其他因素不变,分别考察纤维素酶添加量(60、90、120 、150、180 U/g)、酶解时间(1、2、3、4、5 h)、水分添加量(质量分数55%、60%、65%、70%、75%)和挤出温度(120、130、140、150、160 ℃)对SDF得率的影响。在单因素实验的基础上,采用四因素三水平正交试验优化酶解-挤出复合改性工艺,试验设计因素水平如表1所示。

表1 正交实验因素与水平表

1.3.4 绿豆皮膳食纤维的提取

膳食纤维的提取依据AOAC 991.43《食物中总的、可溶性及不溶性膳食纤维 酶-重量法》进行。

1.3.5 扫描电镜观察

参照刘鸿铖等[14]的方法,取一定量干燥样品粉碎过80 目筛(0.20 mm),镀金后置于扫描电镜中,观察对其表面微观结构,扫描电镜放大倍数为2 000倍。

1.3.6 X-射线衍射分析

X-射线衍射条件:Cu-Kα靶型,扫描区域为5°～45°,采用连续扫描法,速度为2(°)/min,步长为0.02,管电流为40 mA,管电压为40 kV。

1.3.7 傅里叶变换红外光谱分析测定

参照Liu等[15]方法,绿豆皮膳食纤维的傅里叶变换红外光谱曲线通过Nicolet is20傅里叶变换红外光谱仪检测。红外光谱仪分辨率采用4 cm-1,扫描波数范围采用4 000～400 cm-1,累计扫描次数采用32次。

1.3.8 持油力(持水力)测定

参照Wang等[16]的方法,称取0.20 g干燥样品加入一支20 mL洁净的离心管,添加10 mL植物油(蒸馏水)并震荡均匀,采用保鲜膜密封,在室温条件下静置12 h,然后在3 800 r/min的转速下离心分离,去除上清液,并用滤纸吸干剩余的油(水),持油力(持水力)采用式(1)进行计算。

(1)

式中:m0为干燥样品的质量/g;m1为离心管的质量/g;m2为吸油(水)后样品与离心管的质量之和/g。

1.3.9 膨胀力测定

参考Chen等[17]方法,称取0.25 g干燥样品加入10 mL的量筒中,记录样品的体积后添加蒸馏水至5 mL刻度线处,采用保鲜膜密封,在室温条件下静置18 h,将样品吸水膨胀后的体积读取并记录,膨胀力采用式(2)进行计算。

(2)

式中:m为干燥样品质量/g;V0为干燥样品自然堆积的体积/mL;V1为吸水膨胀后样品的体积/mL。

1.3.10 阳离子交换能力测定

称取1.00 g干燥样品加入250 mL的锥形瓶内,迅速移入50 mL 1 mol/L的盐酸溶液并均匀搅拌,采用保鲜膜密封,在室温条件下静置24 h后过滤,并用大量的蒸馏水洗涤样品,直至滤液中检测不出氯离子[18],将滤渣置于锥形瓶内,迅速加入150 mL的5 g/100 mL氯化钠溶液,充分搅拌30 min,然后添加2滴酚酞溶液,最后用氢氧化钠溶液(0.05 mol/L)滴定直到终点,空白对照试验采用蒸馏水滴定,阳离子交换能力采用式(3)进行计算。

基层农业科研事业单位的国有资产主要包括：流动资产（货币资金、往来账款、存货）、固定资产、无形资产和对外投资等。为确保资产的安全和高效使用，应做好以下几方面的工作。

(3)

式中:m为干燥样品质量/g;C为滴定所用氢氧化钠溶液的浓度/mol/L;V0为滴定空白样所用氢氧化钠溶液体积/mL;V1为滴定样品所用氢氧化钠溶液的体积/mL。

1.3.11 吸附胆固醇能力测定

取适量新鲜鸡蛋蛋黄,添加9倍体积的水制成蛋黄乳液。称取0.50 g干燥样品加入一个锥形瓶内,加入蛋黄乳液30 mL并均匀搅拌,分别再用盐酸溶液和氢氧化钠溶液调配pH=2和pH=7的缓冲液[19],然后置于36 ℃恒温水浴中震荡,每隔2 h取出离心分离,吸取1 mL上清液,依据邻苯二甲醛法制成胆固醇的标准工作曲线:y=0.008 8x-0.003 7(R2=0.991 7),并测出吸附前蛋黄乳液中胆固醇质量浓度ρ2,上清液中胆固醇质量浓度ρ1,吸附胆固醇能力采用式(4)进行计算。

(4)

式中:ρ1为上清液中胆固醇质量浓度/mg/mL;ρ2为吸附前蛋黄乳液中胆固醇质量浓度/mg/mL;m为干燥样品质量/g。

1.4 数据处理分析

2 结果与分析

2.1 基础组成成分分析

绿豆皮改性前后的基础成分含量如表2所示。经过挤出-酶解改性处理后,绿豆皮中TDF含量无显著性变化,但SDF含量显著性增加(P<0.05),IDF含量显著降低。这表明,通过酶解-挤出复合改性处理后,绿豆皮中的一部分IDF向SDF转化,这可能是由于纤维素酶破坏了绿豆皮紧致的细胞壁结构,SDF更有利于溶出[20],另一方面在挤出过程中,伴随着高压、高温、高剪切力的作用也会使IDF内的一部分糖苷键断裂转化生成SDF。此外,经酶解-挤出复合改性后,绿豆皮中水分、脂肪、蛋白质及灰分的含量均没有显著性变化。

表2 绿豆皮基础组成质量分数/g/100 g

2.2 单因素实验结果

根据1.3.3节分别研究了纤维素酶添加量、酶解时间、水分添加量和挤出温度对SDF得率的影响,结果见图1。

图1 各因素对绿豆皮SDF得率的影响

由图1a可知,纤维素酶添加量为60～120 U/g范围内,伴随酶添加量的增加,绿豆皮SDF得率也显著提高(P<0.05);然而当酶添加量由120 U/g升到180 U/g时,SDF得率提高不显著(P>0.05),这可能是因为一定量的绿豆皮作为底物,只能同相应量的纤维素酶起作用,一旦纤维素酶超量后,超量的酶不能参与酶解反应[21]。由图1b可知,在开始阶段,SDF得率伴随着酶解时间的进行显著增加(P<0.05);而当酶解时间为3 h,SDF得率曲线上升幅度较小,产生这种现象的原因可能是当反应时间相对过短时,物料与酶的作用不够充分,导致SDF得率低,反应时间过长,酶解反应速率达最大值,最后SDF得率趋于平缓。由图1c可知,随着水质量分数的增加,SDF得率呈现先升高后降低的趋势,在65%时SDF得率达到最大值为(9.21±0.11)%。水分添加量是影响SDF得率的重要因素,物料在经挤出过程中水分添加量过低时,没有充足的蒸汽与其发生作用,物料出现糊化,在挤出机中很难被挤出,易发生堵塞;水分添加量过高时,物料在挤出机中的温度会降低,同时过于湿润的物料也会影响其在挤出机内部的输送能力,发生打滑现象致使挤出效果不佳从而影响SDF的得率[22]。通过单因素方差分析结合图1d可知,挤出温度对SDF得率的影响达到了极显著水平(P<0.01)。SDF得率随着挤出温度的增加呈现先升高后缓慢降低的趋势,在160 ℃时SDF得率达到最大值为(9.45±0.09)%。这是由于相对较低的挤出温度会导致外部能量供应不足,满足不了膨化动力的要求,不利于促使绿豆皮IDF内部的致密结构发生裂解,因而SDF得率不高;而相对过高的挤出温度会使物料发生不同程度的糊化,挤出腔里的压力增大,以致影响SDF的得率[23]。

2.3 正交实验结果

在单因素实验的基础上,进行四因素三水平正交实验,结果见表3～表4。对正交实验的极差和方差进行分析可知,对SDF得率的影响最大的因素是纤维素酶的添加量,然后依次是挤出温度、酶解时间、水分添加量,且4个因素对SDF得率均具有显著性影响(P<0.01),由F值大小顺序为A>D>B>C,与正交表R相对应,因此结果具有较高的可信度。最佳酶解-挤出复合改性工艺条件是A2B3C3D2,即在纤维素酶添加量为120 U/g,酶解时间4 h,水质量分数70%,挤出温度140 ℃时,SDF得率最高。在此最佳工艺条件下进行3次验证性重复实验,SDF得率为(12.74±0.29)%,超过周爱丽[22]报道的挤出改性绿豆皮的SDF得率。验证实验结果表明,最佳酶解-挤出复合改性工艺条件的重复性较好,稳定可靠。

表4 正交实验方差分析结果

2.4 表面微观结构观察

图2表明,改性前绿豆皮膳食纤维具有光滑的表面,同时存在零星可见的褶皱,结构非常致密,表面也黏连少量粗颗粒,可能是绿豆皮上残留的蛋白质[24](图2a);酶解-挤出复合改性处理后,绿豆皮膳食纤维表面呈现大量明显的孔隙与褶皱,导致表面比较粗糙,疏松多孔网状结构十分显著(图2b),这可能是由于在改性处理过程中,绿豆皮膳食纤维受到高压、高温、高剪切力以及酶解的作用,纤维的紧密结构被打开,结构发生重组、断裂,纤维的聚合度大幅度降低[9],这为酶解-挤出复合改性处理后的绿豆皮膳食纤维的持油力、持水力和膨胀力等理化性能的增大提供参考。王旭等[25]报道了通过挤出膨化辅助酶水解提取可溶性膳食纤维后,发现米糠可溶性膳食纤维表面呈蜂窝颗粒状、形态疏松,其持水力、结合水力和溶胀力等物化特性均得到明显改善。

图2 绿豆皮膳食纤维改性前后的扫描电镜图(2 000×)

2.5 X-射线衍射扫描结果

由图3可见,2θ在17°和22°附近的结晶衍射峰比较显著,35°处的小衍射峰是纤维素I晶体典型构型[26]。绿豆皮膳食纤维经过改性处理后,2θ变为16.89°、22.46°,差异不显著(P>0.05),这说明酶解-挤出复合改性处理并未显著改变绿豆皮膳食纤维的结晶构型。使用Jade 7.0 软件拟合后发现,经酶解-挤出复合改性后,绿豆皮膳食纤维的相对结晶度降低了约17%,这可能是由于绿豆皮膳食纤维在酶解-挤出复合改性过程中,部分非结晶区和结晶区的结构受到影响甚至冲破,分子间的凝聚力大幅度降低,导致水溶性成分更容易溶出;与此同时,一部分结晶区转化为非定性区,导致相对结晶度下降,从而使绿豆皮膳食纤维的聚合度降低,有利于改善其持油力、持水力、膨胀力、阳离子交换能力等理化特性[27]。

注:DF-1为未改性绿豆皮膳食纤维;DF-2为酶解-挤出复合改性绿豆皮膳食纤维,下同。

2.6 傅里叶变换红外光谱分析

图4 绿豆皮膳食纤维改性前后的傅里叶变换红外光谱图

2.7 持油力、膨胀力、阳离子交换能力分析

由表5可以看出,绿豆皮膳食纤维在酶解-挤出复合改性处理后,其持油力、膨胀力、阳离子交换能力等理化性能都明显得到改善(P<0.05)。这是由于绿豆皮膳食纤维在复合改性处理过程后,其比表面积大为增加,表现出较多大的孔隙与多层褶皱,有利于亲油基团和亲水基团暴露出来[31],这导致与油和水结合的位点增加,油和水更容易地与绿豆皮膳食纤维结合。另一方面,酶解-挤出复合改性处理也会使一些纤维质大分子降解转化为可溶性小分子成分,这些变化有利于提高膳食纤维的持油力、持水力及膨胀力等理化性能[32]。阳离子交换能力与糖醛酸含量关系密切[33],绿豆皮膳食纤维经过酶解-挤出复合改性处理,其阳离子交换能力明显增强(P<0.05),这可能是由于在酶解-挤出复合改性处理过程中,一些绿豆皮膳食纤维中的糖醛酸基团暴露所致[34]。

2.8 吸附胆固醇能力测定

由图5可以看出,在pH=2和pH=7条件下,绿豆皮膳食纤维在复合改性前后,其对胆固醇的吸附能力都是伴随时间的增加而增大,大约 12 h后吸附基本达到稳定。此外,在同一条件的pH到达吸附稳定时,绿豆皮膳食纤维经过酶解-挤出复合改性后,其吸附胆固醇能力明显提高(P<0.05),这可能是由于SDF的分子质量小于IDF,含有更多极性基团,也有利于胆固醇的吸附[13]。Sera等[35]研究表明,膳食纤维吸附胆固醇的能力与所处条件的pH值息息相关,相同的绿豆皮膳食纤维,其吸附胆固醇能力在环境pH=7时明显要比环境pH=2时高。另一方面,膳食纤维对胆固醇的吸附能力也会受到其表面结构的影响,由于膳食纤维对胆固醇的吸附属于物理吸附过程,绿豆皮膳食纤维经过酶解-挤出改性处理后,其表面出现更多孔隙与褶皱,有利于对胆固醇的吸附。

3 结论

采用单因素实验和正交实验对酶解-挤出复合法改性绿豆皮膳食纤维工艺进行优化,结果表明:在纤维素酶添加量120 U/g,酶解时间4 h,水质量分数70%,挤出温度140 ℃的条件下,SDF得率为(12.74±0.29)%。通过酶解-挤出复合法改性处理后,绿豆皮膳食纤维的表面结构由光滑致密变成蓬松与粗糙,出现了多孔性、多层褶皱特征,比表面积增大。傅里叶变换红外光谱、X-射线衍射结果表明,酶解-挤出复合法改性并没有破坏绿豆皮膳食纤维内部的分子结构,但相应特征吸收峰的强度均有所改变,这主要是因为膳食纤维内部的部分结晶区和非结晶区的结构遭到破坏,以至于一部分结晶区向非定性区转化,最终促使相对结晶度下降。以上的改变使更多的亲油基团和亲水基团从膳食纤维中解放出来,可使膳食纤维得持油力、膨胀力、吸附胆固醇能力和阳离子交换能力等理化性能等理化性能均得到有效提高。后续可利用绿豆皮膳食纤维开发控制体重、降血脂、治疗便秘等功能食品。