威灵仙总皂苷通过miR-410-3p介导调控胶质瘤细胞的生物学活性

任君浩,朝 博,王 飞,武 强

内蒙古医科大学附属医院神经外科,呼和浩特 010059

胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤之一,好发于儿童、青年、中年人群。研究表明,威灵仙总皂苷具有抗炎以及促进软骨缺损修复等作用[1-2],在食管鳞癌、肝癌、口腔癌以及胃癌中均发挥抗癌作用[3]。miR-410-3p与结直肠癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤有关[4-5]。而本课题组在前期预实验中发现miR-410-3p在脑胶质瘤中处于低表达水平。第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten/protein kinase B/mammalian target of rapamycin, PTEN/Akt/mTOR)信号通路是重要的信号转导通路,参与调节细胞分化、增殖和代谢等过程,研究表明,PTEN/Akt/ mTOR信号通路参与调控胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[6]。本研究主要探讨威灵仙总皂苷对U87细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

1 仪器与材料

1.1 仪器

5430R型高速冷冻离心机(上海艾研生物科技有限公司);DNP-9016二氧化碳恒温培养箱(上海铂温仪器有限公司);Varioskan LUX多功能酶标仪(赛默飞世尔科技有限公司)。

1.2 试药

威灵仙总皂苷(质量分数≥91.3%,批号PCS3247,成都植标化纯生物技术有限公司);引物序列由上海生工生物工程研究所合成;转染试剂脂质体lipofectamine 3000(批号L3000075,北京诺为生物技术有限公司);反转录试剂盒(批号RR037A,北京智杰方远科技有限公司);双荧光素酶报告基因检测试剂盒(批号RG027,上海碧云天生物科技有限公司);CCK-8试剂盒(批号CA1210,北京索莱宝科技有限公司);PTEN(批号ab267787)、p-Akt(批号ab8805)、Akt(批号ab18785)、p-mTOR(批号ab109268)以及mTOR(批号ab134903)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH,批号ab8245)抗体,均购自美国Abcam公司。

1.3 细胞系

胶质瘤细胞U87(美国ATCC公司)。

2 方法

2.1 CCK-8法检测细胞存活率

细胞复苏、常规培养、传代,取第3代细胞制成单细胞悬液,并接种于培养板,培养24 h后,每孔加入0、10、20、30、40、50 μmol·L-1威灵仙总皂苷,每个浓度设置3个复孔。1 d后每孔加入工作液10 μL,避光孵育4 h,检测吸光度(A)值。

2.2 细胞转染与分组

取第3代细胞悬液接种于96孔板中,将细胞随机分为对照组、NC组、inhibitor组和inhibitor联合威灵仙总皂苷组,每组设置3个复孔,除对照组外,其余组分别转染miR-410-3p NC和miR-410-3p inhibitor。miR-410-3p inhibitor联合威灵仙总皂苷组转染24 h后加入40 μmol·L-1威灵仙总皂苷处理24 h。

2.3 qRT-PCR法检测细胞中miR-410-3p的表达水平

按照2.2项下方法进行细胞分组和处理,24 h后,预冷PBS清洗3次,离心,收集细胞,提取RNA,严格按照实验步骤进行操作,2-△△CT法计算miR-410-3p表达水平,引物序列见表1。

表1 引物序列

2.4 细胞存活率的检测

24 h后,按照2.1项下的实验方法检测各组细胞存活率,实验重复3次。

2.5 细胞迁移数量的检测

按照2.2项下的方法进行细胞分组和处理,24 h后,将细胞接种于6孔板中,细胞贴壁生长后,在板底部均匀划线,清除细胞碎片,分别在划线0 h和24 h在显微镜下观察并拍照,测定划痕宽度,计算划痕愈合率(%)。

2.6 细胞侵袭数量的检测

按照2.2项下的方法进行细胞分组和处理,24 h后,将细胞悬液100 μL加入铺有基质胶的上室中,下室中加入完全培养基,重新培养24 h,取出后将上室未侵袭的细胞去除,固定,染色,清洗,晾干,显微镜下观察,计算侵袭细胞数量。

2.7 miR-410-3p与PTEN靶向关系的检测

用Targetscan软件进行靶基因预测,构建野生型(WT)-PTEN和突变型(Mut)-PTEN双荧光素酶报告载体,将2种载体、miR-410-3p mimic和miR-410-3p NC共同转染U87细胞,48 h后,测定荧光素酶活性。

2.8 各蛋白相对表达量的检测

按照2.2项下的方法进行细胞分组和处理,24 h后,取细胞裂解,离心,取上清,试剂盒检测蛋白质量浓度。用质量分数为12%的凝胶电泳,湿转,洗膜,室温封闭,PTEN、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR以及GAPDH抗体(1∶1 000)4 ℃孵育过夜,TBST洗膜3次,二抗(1∶5 000)室温孵育2 h,ECL显影,Image J分析条带灰度值。

2.9 统计学方法

3 结果

3.1 不同浓度威灵仙总皂苷对细胞存活率的影响

细胞存活率组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与0 μmol·L-1组比较,其他浓度组细胞存活率均降低,且具有剂量依赖性(P<0.01)。见表2。

表2 各组细胞存活率的比较

3.2 qRT-PCR检测结果

与NC组比较,inhibitor组miR-410-3p表达水平降低(P<0.05);与inhibitor组比较,inhibitor联合威灵仙总皂苷组miR-410-3p表达水平升高(P<0.05)。见表3。

表3 各组细胞中miR-410-3p表达水平的比较

3.3 CCK-8法检测结果

与inhibitor组比较,inhibitor联合威灵仙总皂苷组的细胞存活率降低(P<0.05)。见表4。

表4 各组细胞存活率的比较

3.4 划痕实验检测结果

与NC组比较,inhibitor组划痕愈合率升高(P<0.05);与inhibitor组比较,inhibitor联合威灵仙总皂苷组划痕愈合率降低(P<0.05)。见表5、图1。

注:A.对照组;B.NC组;C.inhibitor组;D.inhibitor联合威灵仙总皂苷组。

表5 各组细胞划痕愈合率的比较

3.5 Transwell实验检测结果

与NC组比较,inhibitor组侵袭细胞数量增多(P<0.05);与inhibitor组比较,inhibitor联合威灵仙总皂苷组侵袭细胞数量减少(P<0.05)。见表6、图2。

注:A.对照组;B.NC组;C.inhibitor组;D.inhibitor联合威灵仙总皂苷组。

表6 各组侵袭细胞数量的比较

3.6 双荧光素酶报告实验检测结果

U87细胞转染WT PTEN和miR-410-3p mimic后,荧光素酶相对活性明显降低。见图3、表7。

图3 miR-410-3p与PTEN的结合位点和突变位点

表7 荧光素酶相对活性

3.7 蛋白印迹法检测结果

与NC组比较,inhibitor组p-Akt和p-mTOR蛋白的相对表达量升高,PTEN蛋白的相对表达量降低(P<0.05);与inhibitor组比较,inhibitor联合威灵仙总皂苷组p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量降低,PTEN蛋白相对表达量升高(P<0.05);对照组和NC组PTEN、p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表8、图4。

注:A.对照组;B.NC组;C.inhibitor组;D. inhibitor联合威灵仙总皂苷组。

表8 各组细胞中蛋白相对表达量的比较

4 讨论

胶质瘤的难治性主要表现在癌细胞自身具有较强的增殖、迁移和侵袭能力[7]。目前,主要用手术切除和化疗等治疗手段,但长期使用化疗药物易出现耐药性,使得治疗效果不理想[8]。因此,寻找新的有效治疗胶质瘤的药物至关重要。近年来,中药在治疗胶质瘤中的作用受到广泛关注,白藜芦醇通过抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭促进凋亡[9]。威灵仙是我国传统中药,具有祛风湿、通经络、化痰和消积等功效,威灵仙总皂苷是其主要活性成分之一。本研究用不同剂量威灵仙总皂苷处理胶质瘤U87细胞,结果显示细胞存活率随威灵仙总皂苷浓度的升高而降低,且具有剂量依赖性。近年来,miR-410-3p在肿瘤中的作用受到广泛关注,舒芬太尼可通过上调miR-410-3p的表达从而减弱膀胱癌细胞增殖、迁移及侵袭能力,诱导细胞凋亡[10]。miR-410-3p在骨肉瘤细胞中高表达,可增强骨肉瘤细胞对化疗药物顺铂的敏感性,降低耐药性,从而抑制癌细胞增殖[11]。

miR-410-3p表达上调可抑制横纹肌肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,诱导癌细胞凋亡[12]。miR-410-3p表达上调可增强黑色素瘤细胞对化疗药物的敏感性[13]。为进一步探讨威灵仙总皂苷是否能通过调节miR-410-3p的表达参与调控胶质瘤细胞的生物活性,本研究通过在U87细胞内转染miR-410-3p inhibitor后,miR-410-3p表达下调,表明成功降低miR-410-3p的表达量,而用威灵仙总皂苷则可使miR-410-3p的表达量增加。miR-410-3p表达降低有利于细胞存活、迁移和侵袭,而用威灵仙总皂苷处理后,细胞存活率和划痕愈合率降低,侵袭细胞数量减少。结果表明,威灵仙总皂苷可上调miR-410-3p的表达,抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。

PTEN是一个编码双重特异性磷酸酶活性产物的抑癌基因,同时具有脂质磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性,通过降低细胞生长和分裂速度,参与调控细胞分裂周期[14]。Akt在调节细胞增殖和代谢方面发挥重要作用,一旦细胞受到外界刺激,Akt将被PI3K激活,进而活化下游mTOR信号[15-16]。PTEN通过负调控PI3K/Akt/mTOR信号通路,在多种肿瘤中发挥抗癌作用[17]。WANG B等[18]研究发现,ACK1通过调节PTEN/Akt/mTOR信号通路促进肝癌的发生、发展。没食子儿茶素通过降低卵巢癌细胞中PTEN的表达量,升高p-Akt和p-mTOR的表量达,从而抑制SKOV3细胞的增殖活性,但PTEN抑制剂可消除其抑癌作用[19]。 GAO S等[20]研究表明miR-146b通过靶向PTEN/Akt/mTOR信号通路抑制前列腺癌自噬,在治疗前列腺癌中具有潜在的应用前景。本研究证实miR-410-3p可靶向作用于PTEN。此外,miR-410-3p的表达下调后,细胞中PTEN蛋白的表达量降低,p-Akt和p-mTOR蛋白的表达量升高;给予威灵仙总皂苷上调miR-410-3p的表达后,细胞中PTEN蛋白的表达量升高,p-Akt和p-mTOR蛋白的表达量降低。结果表明,miR-410-3p参与调节PTEN/Akt/mTOR信号通路。

综上所述,威灵仙总皂苷可抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭,其可能是通过调节miR-410-3p介导的PTEN/Akt/mTOR信号通路发挥作用,为临床治疗胶质瘤提供理论依据。