地黄除痹乳膏的质量标准研究

苏 捷,杨贤海,付大清,马小青,郑光明,左小明

荆门市中医医院,荆门 448000

地黄除痹乳膏是由荆楚名老中医朱必泉临床治疗痹症的外用验方痹痛散改变剂型而得,是荆门市中医医院的拟开发制剂。地黄除痹乳膏由地黄、当归、三七、丹参、乳香、没药组成。方中地黄为君药,有活血化瘀之效,广泛应用于血热瘀血证和外伤瘀血证的治疗[1]。当归、三七、丹参共为臣药,具有补血活血、散瘀止痛之功效,用于治疗风湿痹痛、跌打损伤[2-4]。乳香、没药为佐药,能活血化瘀止痛,二者合用,可用于瘀滞痛证的治疗[5]。上述诸药合用,共奏化瘀通滞、逐痹止痛之功。因缺乏完善的质量标准,为保障地黄除痹乳膏的临床疗效,本研究用薄层色谱法(thin layer chromatography,TLC)对制剂中的地黄、当归、三七进行定性鉴别。并以梓醇、地黄苷D、阿魏酸、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1为质量标志成分,用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography ,HPLC)测定其含量,以期有效控制地黄除痹乳膏的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1525型高效液相色谱仪、2489型紫外检测器均购自美国Waters公司;GE0505十万分之一电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司);KQ-250B台式超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);ZF-6三用紫外分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)。

1.2 试药

对照品:梓醇(批号110808-202112,质量分数为98.8%)、毛蕊花糖苷(批号111530-201914,质量分数为95.2%)、人参皂苷Rg1(批号110703-202034,质量分数为94.0%)、人参皂苷Rb1(批号110704-202028,质量分数为93.1%)、三七皂苷R1(批号110745-201921,质量分数为90.4%)、当归(批号120927-201617)、三七(批号120941-201810)均购自中国食品药品检定研究院;地黄苷D(批号MUST-21052010,质量分数为99.19%)、阿魏酸(批号MUST-21060504,质量分数为99.94%)均购自成都曼斯特生物科技有限公司;HPLC/ACS级乙腈(批号L9A0T49,河北百灵威超精细材料有限公司);色谱级磷酸(批号C1907082,阿拉丁化学试剂有限公司);硅胶G薄层板(批号20190307,青岛海洋化工厂分厂);水为超纯水;其他试剂均为分析纯。地黄除痹乳膏(批号:20211101、20211201、20220101、20220102、20220201)及各阴性样品由荆门市中医医院制剂室提供。

2 方法与结果

2.1 地黄、当归、三七的定性鉴别

2.1.1地黄的TLC鉴别 取地黄除痹乳膏1 g,加20 mL体积分数为80%的甲醇溶液超声提取15 min,过滤后蒸干滤液,加2.5 mL水溶解残渣,用5 mL水饱和的正丁醇振摇提取3次,合并正丁醇层并蒸干,残渣加1 mL甲醇溶解,即得供试品溶液[6-8]。另取缺地黄阴性样品1 g同法制成阴性对照溶液。再取毛蕊花糖苷对照品约1 mg,加甲醇1 mL溶解制成对照品溶液。吸取上述溶液各5 μL,点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-甲醇-甲酸(8∶0.25∶1)溶液展开,取出并晾干,于365 nm紫外光灯下观察,见图1。由图1可见,供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点,阴性对照无干扰。

注:1.阴性对照溶液;2.毛蕊花糖苷对照品;3～5.供试品。

2.1.2当归的TLC鉴别 取地黄除痹乳膏2.5 g,加乙醚30 mL,超声15 min,过滤,蒸干滤液,加1 mL乙醇溶解残渣,作为供试品溶液。另取缺当归阴性样品2.5 g、当归对照药材0.5 g,同法制成阴性对照溶液及对照药材溶液。吸取上述溶液各10 μL,点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-正己烷(1∶4)溶液展开,取出并晾干,于365 nm紫外光灯下观察[9],见图2。由图2可见,供试品色谱在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点,阴性对照无干扰。

注:1.阴性对照溶液;2.当归对照药材;3～5.供试品。

2.1.3三七的TLC鉴别 取地黄除痹乳膏2.0 g,加2 mL水混匀,加10 mL水饱和的正丁醇振摇10 min,静置1 h后离心,取上清液,用正丁醇饱和的水溶液以3倍量混匀,静置,取正丁醇层并蒸干,加甲醇1 mL溶解残渣制成供试品溶液。另取缺三七阴性样品2.0 g、三七对照药材0.5 g,同法制成阴性对照溶液和对照药材溶液。再取三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1对照品,加甲醇制成质量浓度均为0.25 mg·mL-1的对照品溶液。吸取上述溶液各10 μL,点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-甲醇-三氯甲烷-水(8∶4.4∶3∶2)在10 ℃以下放置的下层溶液展开,取出晾干,以体积分数为10%的硫酸溶液喷于薄层板,于105 ℃条件下加热至斑点清晰显色[10-11],见图3。由图3可见,供试品色谱在与对照品及对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点,且阴性对照无干扰。

注:1.人参皂苷Rb1对照品;2.三七皂苷R1对照品;3.人参皂苷Rg1对照品;4.三七对照药材;5～7.供试品;8.阴性对照溶液。

2.2 含量测定

2.2.1色谱条件 Waters Symmetry C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。以乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸溶液(B)为流动相,梯度洗脱(0～15 min,2%～10% A;15～20 min,10%～20% A;20～40 min,20%～35% A;40～45 min,35%～40% A;45～50 min,40%～2% A)。检测波长为203 nm(梓醇、地黄苷D、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1)和316 nm(阿魏酸);柱温为30 ℃;流速为1.0 mL·min-1;进样量为10 μL。

2.2.2对照品溶液的制备 精密称取梓醇对照品0.009 94 g、地黄苷D对照品0.011 98 g、阿魏酸对照品0.002 68 g、三七皂苷R1对照品0.011 77 g、人参皂苷Rg1对照品0.025 79 g、人参皂苷Rb1对照品0.022 43 g,置于50 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,得到上述对照品质量浓度分别为0.196 4、0.237 6、0.053 6、0.212 8、0.484 8、0.417 6 mg·mL-1的储备液。精密吸取储备液2.5 mL,置于10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得混合对照品溶液。

2.2.3供试品溶液的制备 精密称取地黄除痹乳膏及各阴性样品2 g,置于锥形瓶中,精密加入体积分数为60%的甲醇溶液50 mL,称定质量,加热回流提取30 min,冷却至室温后称定质量,以体积分数为60%的甲醇溶液补足减失的质量,摇匀,滤过,即得供试品溶液及各阴性对照溶液。

2.2.4系统适用性及专属性实验 精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及各阴性溶液,按照2.2.1项下色谱条件进行测定,记录色谱图。见图4。由图4可见,各目标成分峰与其他杂质峰均能达到基线分离,阴性对照溶液对各目标成分的测定无干扰。

注:A.203 nm;B.316 nm。a.混合对照品溶液;b.供试品溶液;c.缺地黄阴性对照溶液;d.缺三七阴性对照溶液;e.缺当归阴性对照溶液。1.梓醇;2.地黄苷D;3.阿魏酸;4.三七皂苷R1;5.人参皂苷Rg1;6.人参皂苷Rb1。

2.2.5线性关系考察 精密量取2.2.2项下储备液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL,分别置于10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,得到6个不同质量浓度的溶液。按照2.2.1项下色谱条件进行测定,以峰面积为纵坐标(y)、质量浓度为横坐标(x),进行线性回归分析,结果见表1。

表1 各成分的回归方程及线性范围

2.2.6精密度实验 精密吸取2.2.2项下混合对照品溶液10 μL,按照2.2.1项下色谱条件连续测定6次,测得梓醇、地黄苷D、阿魏酸、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1峰面积的RSD值分别为1.13%、1.36%、0.86%、1.19%、0.98%、1.06%,表明仪器的精密度良好。

2.2.7稳定性实验 取2.2.3项下供试品溶液,按照2.2.1项下色谱条件测定,分别于0、2、4、8、12、24 h测得溶液梓醇、地黄苷D、阿魏酸、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1峰面积的RSD值分别为1.81%、1.65%、1.55%、1.34%、1.29%、1.83%,表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.8重复性实验 精密称取2 g地黄除痹乳膏6份,按照2.2.3项下方法制备供试品溶液,按照2.2.1项下色谱条件进行测定,测得梓醇、地黄苷D、阿魏酸、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1峰面积的RSD值分别为1.64%、1.36%、1.74%、1.89%、1.51%、1.98%,表明该方法的重复性较好。

2.2.9回收率实验 精密称取1 g含量已知的地黄除痹乳膏6份,分别置于锥形瓶中,精密加入配制的混合对照品溶液(梓醇、地黄苷D、阿魏酸、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1质量浓度分别为0.452 1、0.373 6、0.032 2、0.331 5、1.057 3、0.195 1 mg·mL-1)1 mL,精密加入体积分数为60%的甲醇溶液49 mL,按照2.2.3项下方法加热回流提取,制备供试品溶液,按照2.2.1项下色谱条件分别进样测定,各成分的回收率见表2。

表2 地黄除痹乳膏各成分的回收率

2.2.10供试品含量的测定 精密称取5批地黄除痹乳膏,按照2.2.3项下方法制备供试品溶液,按照2.2.1项下色谱条件测定,计算各成分的含量。见表3。

表3 地黄除痹乳膏各成分的含量测定结果 (n=3)

3 讨论

3.1 地黄除痹乳膏TLC鉴别药材的选择

地黄除痹乳膏由6味药组成,为保证制剂质量及有效性,本研究用TLC对方中君药地黄和臣药当归、三七3味药进行定性鉴别,并进行专属性、系统适用性考察。建立的TLC鉴别方法能准确鉴别地黄除痹乳膏中的上述3味药。

3.2 含量测定质量标志成分的确定

地黄中含量最高的是环烯醚萜类化合物,而环烯醚萜类化合物中梓醇和地黄苷D为地黄的重要药效成分[12-13]。当归中有机酸类成分可作为当归质量标志物[14],有机酸类阿魏酸为当归补血活血的物质基础[15]。三七的主要活性成分及主要活血成分为三七总皂苷[16],《中华人民共和国药典》规定,三七中三七皂苷R1和人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的总含量不得低于5.0%[11]。为确保制剂的疗效稳定可靠,本研究将上述6个成分确定为地黄除痹乳膏含量测定的质量标志成分。

3.3 供试品溶液制备方法的选择

本研究前期考察体积分数为45%、60%、75%的甲醇溶液的提取效果,结果显示,在超声处理相同时间(30 min)后,体积分数为60%的甲醇溶液提取效果最好。确定提取溶剂后,本研究还考察了超声30、45 min与加热回流30 min的提取效果,结果显示,与超声30、45 min比较,加热回流30 min对阿魏酸和人参皂苷Rb1的提取更完全。结果表明,加热回流30 min提取效果最优。

3.4 流动相的确定

本研究参考文献方法[17-20],考察了1 mL·L-1磷酸溶液-甲醇与1 mL·L-1磷酸溶液-乙腈为流动相的洗脱效果。结果显示,相比于1 mL·L-1磷酸溶液-甲醇,当以1 mL·L-1磷酸溶液-乙腈为流动相时,6个指标成分的保留时间均较短,且峰形佳;在低检测波长(203 nm)条件下,鬼峰数量少,故确定1 mL·L-1磷酸溶液-乙腈为流动相。

综上所述,本研究建立的TLC能对地黄除痹乳膏中的地黄、当归及三七进行准确鉴别,且方法简便、可靠、专属性强。虽未对制剂处方中的所有药味进行定性鉴别,不能完全评价其质量,但定性鉴别的药味中包含了君药地黄以及相对较贵重的三七,故能够部分评价和控制其质量。建立了新的能同时测定地黄除痹乳膏中梓醇、地黄苷D、阿魏酸、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1含量的HPLC新方法,可用于地黄除痹乳膏的质量评价。