HPLC联合化学计量学及EW-TOPSIS法评价不同产地马齿苋的质量

徐 晓,徐 凯,钟 贞

丽珠集团丽珠制药厂, 珠海 519045

马齿苋为马齿苋科植物马齿苋PortulacaoleraceaL.的干燥地上部分,具有清热解毒、凉血止血、止痢的功效,用于治疗热毒血痢、痈肿疔疮、湿疹、丹毒、蛇虫咬伤、便血、痔血及崩漏下血疗效显著[1]。马齿苋应用广泛,具有抗炎、抑菌、降血脂、降血糖、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、增强免疫等作用[2],另外马齿苋还有一定的营养保健作用。马齿苋药源丰富,具有广阔的开发和利用前景。马齿苋含有多种化学成分,主要含有香豆素类、有机酚酸类、黄酮类、生物碱类、萜类以及多糖、挥发油等成分[3-4]。因中药材种属来源复杂、成分间相互作用,其产品质量直接影响中成药制剂的质量和临床疗效,因此有效控制中药材的质量是保证中医临床疗效的前提。多组分定量控制[5]评价模式较单指标控制能更全面地反映中药的整体质量。化学计量学[6-7]通过对多变量数值进行分组归类,从多指标变量中筛选主要指标,挖掘影响产品质量的主要潜在标志物;熵权-逼近理想解排序法(entropy weight-technique for order preference by similarity to an ideal solution,EW-TOPSIS)[8-9]将原始数据进行归一化处理,通过计算各评价指标与理想解之间的接近程度,对样品的质量优劣进行排序,现已广泛应用于中药材及其制剂的质量评价。

本研究收集来自于四川、贵州、河南、辽宁、吉林5个省的18批马齿苋,用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)对马齿苋中有机酚酸类(柠檬酸、琥珀酸和咖啡酸等)、黄酮类(染料木苷、木犀草素和槲皮素等)、香豆素类成分(东莨菪亭、6,7-二羟基香豆素、异茴香内酯、佛手柑内酯等)含量进行同时测定,建立马齿苋多组分定量控制评价模式,再用EW-TOPSIS法挖掘影响马齿苋产品质量的差异性标志物,对不同产地来源的马齿苋进行质量评价,以期为马齿苋有效性的综合评价和内在质量的全面控制奠定实验基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司);XSR225型电子分析天平(瑞士梅特勒公司);KQ-250B型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

对照品:咖啡酸(批号110885-201703,质量分数99.7%)、染料木苷(批号111709-201702,质量分数99.9%)、槲皮素(批号100081-201610,质量分数99.8%)、佛手柑内酯(批号112078-202101,质量分数99.2%)、柠檬酸(批号111679-201602,质量分数97.0%)和木犀草素(批号111520-202107,质量分数96.3%)均购自中国食品药品检定研究院;琥珀酸(批号PRF7012622,质量分数99.9%)、东莨菪亭(批号PRF9102221,质量分数99.9%)、6,7-二羟基香豆素(批号PRF8041741,质量分数99.9%)和异茴香内酯(批号PRF9062222,质量分数99.2%)均购自成都普瑞法科技开发有限公司;乙腈、磷酸和配流动相用甲醇均为色谱纯,其余试剂为分析纯。马齿苋为马齿苋科植物马齿苋PortulacaoleraceaL.的干燥地上部分,经钟贞副主任药师鉴定为正品,信息见表1。

表1 马齿苋的药材信息

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备

取柠檬酸、琥珀酸、咖啡酸、染料木苷、木犀草素、槲皮素、东莨菪亭、6,7-二羟基香豆素、异茴香内酯、佛手柑内酯对照品适量,用体积分数为70%的甲醇制成质量浓度分别为0.494、0.450、0.142、0.218、1.180、0.374、0.056、0.092、0.170、0.158 g·L-1的混合对照品储备液,再将储备液用体积分数为70%的甲醇稀释20倍制得上述10种对照品质量浓度分别为24.7、22.5、7.1、10.9、59.0、18.7、2.8、4.6、8.5、7.9 mg·L-1的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取马齿苋粉末约2.0 g,加体积分数为70%的甲醇超声处理30 min,放冷,用同一溶剂定容至25 mL,摇匀,过滤,即得。

2.3 色谱条件

用Alltima HP HiLord C18液相色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱温为30 ℃;检测波长分别为210 nm(0～16 min检测柠檬酸、琥珀酸和咖啡酸)[10-13]、360 nm(16～29 min检测染料木苷、木犀草素和槲皮素)[14-17]、320 nm(29～50 min检测东莨菪亭、6,7-二羟基香豆素、异茴香内酯和佛手柑内酯)[18-21]。流动相为1 mL·L-1磷酸(A)-乙腈(B),梯度洗脱(0～8 min,18.0% B;8～16 min,18.0%～25.0% B;16～29 min,25.0%～48.0% B;29～42 min,48.0%～90.0% B;42～50 min,90.0%～18.0% B)。流速为1.0 mL·min-1;进样量为10 μL。

2.4 方法学考察

2.4.1专属性实验 按照2.3项下色谱条件进样混合对照品溶液及供试品溶液,记录色谱图,见图1。由图1可见,马齿苋供试品溶液中10种成分与相邻色谱峰分离良好(分离度均≥1.5),与对照品溶液色谱峰保留时间一致。

注:A.混合对照品;B.马齿苋供试品;1.柠檬酸;2.琥珀酸;3.咖啡酸;4.染料木苷;5.木犀草素;6.槲皮素;7.东莨菪亭;8.6,7-二羟基香豆素;9.异茴香内酯;10.佛手柑内酯。

2.4.2线性关系考察 精密吸取2.1项下混合对照品储备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL,分别用上述溶剂稀释200、100、40、20、10、4倍,摇匀制得系列线性工作溶液1～6,按照2.3项下色谱条件进样检测,记录色谱图,以柠檬酸、琥珀酸、咖啡酸、染料木苷、木犀草素、槲皮素、东莨菪亭、6,7-二羟基香豆素、异茴香内酯、佛手柑内酯对照品质量浓度为横坐标(x),以峰面积为纵坐标(y)进行线性回归,结果见表2。

表2 马齿苋中各成分的线性关系

2.4.3精密度实验 按照2.3项色谱条件重复进样混合对照品溶液6次,记录柠檬酸、琥珀酸、咖啡酸、染料木苷、木犀草素、槲皮素、东莨菪亭、6,7-二羟基香豆素、异茴香内酯、佛手柑内酯色谱曲线的峰面积。计算得曲线峰面积的RSD值依次为0.89%、1.21%、1.35%、0.91%、0.59%、1.08%、1.52%、1.37%、1.13%、1.42%,表明精密度良好。

2.4.4稳定性实验 取一份马齿苋(编号S1)供试品溶液,于制备后0、2、5、9、14、20、24 h进样,记录柠檬酸、琥珀酸、咖啡酸、染料木苷、木犀草素、槲皮素、东莨菪亭、6,7-二羟基香豆素、异茴香内酯、佛手柑内酯色谱曲线的峰面积。计算得曲线峰面积的RSD值依次为0.92%、1.19%、1.28%、0.71%、0.64%、1.23%、1.22%、1.43%、1.15%、1.32%,表明马齿苋供试品溶液24 h内稳定。

2.4.5重复性实验 取马齿苋(编号S1)适量,按照2.2项下方法制备马齿苋供试品溶液6份,按照2.3项下色谱条件检测分析,记录色谱曲线,用外标法计算柠檬酸、琥珀酸、咖啡酸、染料木苷、木犀草素、槲皮素、东莨菪亭、6,7-二羟基香豆素、异茴香内酯、佛手柑内酯的含量。计算得其含量的RSD值依次为1.19%、1.25%、1.67%、1.79%、1.33%、1.51%、1.86%、1.71%、1.58%、1.44%,表明重复性良好。

2.4.6准确度实验 取马齿苋(编号S1)细粉9份,每份精密称定1.0 g,分别按各成分含量的80%、100%、120%加入混合对照品溶液(柠檬酸、琥珀酸、咖啡酸、染料木苷、木犀草素、槲皮素、东莨菪亭、6,7-二羟基香豆素、异茴香内酯、佛手柑内酯对照品质量浓度分别为0.361、0.317、0.098、0.169、0.887、0.274、0.043、0.067、0.135、0.117 g·L-1),每个质量浓度平行操作3次,再按照2.2项下方法制得加样供试品溶液,按照2.3项色谱条件下检测。计算得10种成分的平均加样回收率分别为100.02%、99.44%、96.97%、98.03%、100.14%、97.89%、97.09%、96.92%、98.17%、99.38%;RSD值分别为0.89%、1.22%、1.42%、1.58%、0.64%、1.60%、1.15%、0.92%、1.39%、0.85%。

2.5 含量测定

取18批马齿苋(S1～S18),依法制备马齿苋供试品溶液,按照2.3项下色谱条件进样分析,用外标法计算马齿苋中柠檬酸、琥珀酸、咖啡酸、染料木苷、木犀草素、槲皮素、东莨菪亭、6,7-二羟基香豆素、异茴香内酯和佛手柑内酯的含量。见表3。

表3 马齿苋中10种成分含量的测定结果 (n=3)

2.6 聚类分析(cluster analysis,CA)

将表3中18批马齿苋的10种成分含量测定结果导入SPSS 26.0统计软件,用平均联接(组间)法,用欧氏距离对样品的测度进行CA,得聚类树状图,见图2。由图2可见,当间距为10时,18批马齿苋样品聚为3类,S1、S5、S2、S4、S3共5批样品聚为一类,S11、S12、S9、S7、S10、S6、S8共7批样品聚为一类,S13、S15、S14、S16、S17、S18共6批样品聚为一类。

图2 18批马齿苋样品聚类树状图

2.7 主成分分析(principal component analysis,PCA)

将表3中18批马齿苋的10种成分含量数据导入SPSS 26.0统计软件,用降维的方式进行PCA,见表4、表5。由表4可见,有2个主成分特征值大于1,累计方差贡献率为85.072%,大于85%,表明选取前2个主成分即可代表马齿苋85.072%的信息量。由表5可见,第一主成分的信息来自琥珀酸、咖啡酸、染料木苷、木犀草素、槲皮素、东莨菪亭、6,7-二羟基香豆素、异茴香内酯等成分的综合,第二主成分的信息由柠檬酸、琥珀酸和佛手柑内酯提供。同时用统计软件SIMCA 14.1建立PCA模型,18批马齿苋样品PCA得分图见图3,共提取出2个主成分,R2x为0.851,大于0.5,所建立的模型稳定性较高。由图3可见,S1～S5、S6～S12及S13～S18分别呈一定关联性,与CA结果一致。

图3 PCA得分图

表4 马齿苋主成分分析的结果

表5 马齿苋10种成分的成分矩阵

2.8 正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)

将表3中10种成分含量数据导入SIMCA 14.1统计软件,运行OPLS-DA程序,见图4。结果显示,模型的主成分回归系数Q2为0.836,大于0.5,表明模型的预测能力较强,反映样本具有明确分离的趋势。R2y为0.868,表明模型的拟合度较好。对所建立的OPLS-DA模型中2个主成分进行200次置换检验,见图5,结果显示,R2拟合直线在y轴截距为0.055,小于0.3,表明所建立的模型可靠;Q2拟合直线与y轴交点为-0.421(为负数),表明所构建的模型未过度拟合,预测能力好,可有效判别18批马齿苋的质量差异。根据变量重要性投影(variable importance in projection,VIP)值筛选影响马齿苋化学成分差异的标志性成分,见图6。由图6可见,木犀草素(VIP=1.841)、槲皮素(VIP=1.255)、琥珀酸(VIP=1.247)和柠檬酸(VIP=1.205)为影响马齿苋产品质量的主要潜在标志物(VIP值均>1)。

图4 18批马齿苋样品的OPLS-DA模型得分图

图5 OPLS-DA置换检测结果图

图6 18批马齿苋样品的VIP图

2.9 EW-TOPSIS法分析

表6 18批马齿苋样品中各成分归一化处理结果

表7 18批马齿苋样品加权决策矩阵

表8 马齿苋的质量评价排序

3 讨论与结论

3.1 提取方法和溶剂的选择

本实验在制备供试品溶液时,对提取方法和溶剂进行了考察。选用不同体积分数的乙醇和甲醇,结果显示,当以体积分数为70%的甲醇为溶剂时,10种成分的提取率均较高。对提取方式及时间进行了考察,结果发现,以体积分数为70%的甲醇超声提取30 min时,10种成分的提取率最高,操作简便、高效。

3.2 色谱条件的确定

在选择流动相时,首先考察了甲醇-水和乙腈-水不同梯度洗脱程序,比较各洗脱程序下的色谱曲线,结果显示以乙腈-水系统为流动相效果较好,但基线略有漂移,柠檬酸、琥珀酸和咖啡酸色谱峰不能正常积分,遂考虑加入不同体积分数磷酸溶液(0.5 mL、1、2 mL·L-1)进行改善,最终以乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液作为流动相系统时,各峰的分离度较好,且色谱峰保留时间适中。本实验通过对10个指标成分对照品溶液进行190～400 nm全波长扫描,参考《中华人民共和国药典》及相关文献,综合基线平稳情况、色谱峰分离情况及色谱峰数量等,最终选择在210 nm波长处检测柠檬酸、琥珀酸和咖啡酸,在360 nm波长处检测染料木苷、木犀草素和槲皮素,在320 nm波长处检测东莨菪亭、6,7-二羟基香豆素、异茴香内酯和佛手柑内酯。

3.3 化学模式识别结果分析

CA和PCA分析结果均显示,18批不同产地马齿苋呈明显的分类趋势,明显聚为3类,S1～S5为一类、S6～S12为一类,S13～S18为一类,分析结果表明不同产地的马齿苋质量有差异,需要综合整体化学成分的含量特征进行质量评价。OPLS-DA分析找出4个影响马齿苋分类的主要生物标志物,即木犀草素、槲皮素、琥珀酸和柠檬酸,它们可能是影响马齿苋产品质量的主要潜在标志物。EW-TOPSIS结果显示,四川和贵州地区所产马齿苋的质量最优,其次为河南、辽宁和吉林。

马齿苋为一种分布较广的药食两用植物,主要含有机酚酸类、黄酮类、香豆素类及生物碱类成分,其中柠檬酸、琥珀酸和咖啡酸等为有机酚酸类主要成分,染料木苷、木犀草素和槲皮素等为黄酮类主要成分,东莨菪亭、6,7-二羟基香豆素、异茴香内酯和佛手柑内酯等为香豆素类主要成分。现代研究表明,马齿苋黄酮类成分具有降血糖、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗炎、抗纤维化、提高记忆力、抑制黑色素生成等多种生物活性[22],还可以通过免疫调节机制治疗慢性前列腺炎[23];马齿苋有机酚酸类成分具有抗炎、镇痛、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抑制血小板等作用[24];马齿苋香豆素类物质具有抗细胞增生、防止血管硬化、抗凝血等作用[25]。王妙颖[26]研究表明柠檬酸能够改善高脂血症动物的血脂和血糖,提高耐糖能力,减弱胰岛素抵抗,影响与糖代谢相关基因及蛋白的活性,有效改善糖代谢紊乱;同时柠檬酸可抑制变形链球菌产酸,对副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌均有较强的抑菌作用[27]。黄国文等[28]研究表明,琥珀酸可显著改善产肠毒素大肠杆菌K88感染小鼠的肠道炎症,对金黄色葡萄球菌、卡他球菌以及伤寒杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌具有抑制作用。槲皮素具有良好的降血糖、降血压、抗炎、抗流感病毒、抑菌、抗衰老及心血管保护作用[29]。王琪等[30]研究表明木犀草素抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化及抗病毒作用显著。上述研究进一步验证了本文筛选出的标志物柠檬酸、琥珀酸、槲皮素和木犀草素是直接影响马齿苋产品质量的化合物。本研究所建立的多指标成分定量控制及化学计量学结合EW-TOPSIS评价方法对稳定马齿苋质量、进一步探讨马齿苋的药效差异及资源的合理利用提供了数据支持。